肾小管细胞来源的细胞外囊泡miR-491-3p通过抑制巨噬细胞SIRT1介导的NICD去乙酰化驱动的泛素-蛋白酶体降解加重肾缺血再灌注损伤

《Research》：Tubular-Cell-Derived Extracellular Vesicle miR-491-3p Aggravates Renal Ischemia–Reperfusion Injury by Inhibiting Macrophage SIRT1-Mediated Notch Intracellular Domain Deacetylation-Driven Ubiquitin–Proteasome Degradation

本研究聚焦于肾缺血再灌注损伤（IRI）中肾小管上皮细胞（TECs）与巨噬细胞相互作用的关键机制。研究人员发现，缺氧/复氧处理的TECs释放富含miR-491-3p的细胞外囊泡（EVs），该miRNA被巨噬细胞摄取后直接靶向沉默信息调节因子1（SIRT1），抑制其对Notch细胞内结构域（NICD）的去乙酰化作用，从而阻碍E3泛素连接酶FBXW7介导的NICD泛素化降解，稳定NICD并激活Notch/NF-κB信号通路，最终促进巨噬细胞M1极化，加剧肾脏炎症反应和组织损伤。该研究揭示了EV-miR-491-3p/SIRT1/NICD轴在肾IRI中的新作用，为急性肾损伤（AKI）的诊疗提供了潜在新靶点。

　　

肾脏是人体重要的排泄和代谢器官，对血流灌注和氧气供应极为敏感。在临床实践中，诸如肾部分切除术、肾动脉阻断等外科操作常常不可避免地导致肾脏血流暂时中断，即缺血。当血流恢复时，会引发更为复杂的再灌注损伤，统称为肾缺血再灌注损伤（Ischemia-Reperfusion Injury, IRI）。这种损伤是导致急性肾损伤（Acute Kidney Injury, AKI）的主要原因之一，严重时可进展为慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease, CKD），甚至需要透析治疗，给患者和社会带来沉重负担。因此，深入探究肾IRI的发病机制，寻找有效的干预靶点，是肾脏病研究领域的重要课题。

在肾IRI的复杂病理过程中，肾小管上皮细胞（Tubular Epithelial Cells, TECs）因其高代谢特性而首当其冲，容易受损。同时，作为肾脏内主要的免疫细胞，巨噬细胞被迅速激活并浸润到损伤部位。巨噬细胞具有可塑性，通常可分为促炎的M1型和抗炎修复的M2型。在IRI早期，M1型巨噬细胞占主导，释放大量白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子，加剧组织炎症和细胞凋亡。长期以来，科学家们知道TECs和巨噬细胞之间存在密切的“对话”，但这种对话的具体分子载体和精细调控机制，尤其是TECs如何精确地“指令”巨噬细胞向有害的M1表型极化，仍是未解之谜。近年来，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的关键信使备受关注。它们是细胞释放的纳米级膜性小泡，携带蛋白质、脂质、核酸（如微小RNA, microRNA/miRNA）等生物活性分子，能够被受体细胞摄取，从而影响其功能。那么，在肾IRI的应激环境下，受损的TECs是否会释放特定的EVs，这些EVs又是否以及如何调控巨噬细胞的命运，进而影响肾脏损伤的进程呢？为了回答这些问题，研究人员在《Research》上发表了他们的最新研究成果。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。他们建立了小鼠肾IRI模型（单侧肾动脉夹闭）和体外细胞缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation, H/R）模型来模拟疾病过程。通过超速离心结合纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）和透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）等技术分离和鉴定了TECs来源的EVs。利用Rab27a基因敲除（Knockout, KO）小鼠和small interfering RNA（siRNA）技术来抑制EVs的分泌。通过microRNA测序、双荧光素酶报告基因实验、RNA Pull-down、蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）、Western blotting、实时定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）、流式细胞术、免疫荧光染色、酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）等多种分子和细胞生物学方法，深入探究了miR-491-3p的功能、其靶基因以及下游信号通路。此外，还利用生物信息学数据库（如TargetScan、miRDB）进行靶基因预测和通路富集分析。

研究结果

巨噬细胞介导的炎症反应加重小鼠IR模型中的肾损伤

研究人员首先成功构建了小鼠肾IRI模型。结果显示，与假手术组相比，IRI后小鼠肾功能指标（血清肌酐、尿素氮）显著升高，肾组织出现明显损伤和细胞凋亡。更重要的是，巨噬细胞浸润增加，并且主要向促炎的M1表型（标志物CD86、iNOS表达上调）极化，同时血清和肾组织中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子水平持续维持在高位。当使用氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞后，肾组织损伤、细胞凋亡和炎症反应均显著减轻。这证实了巨噬细胞，特别是M1型巨噬细胞，在肾IRI中发挥了关键的促炎和损伤作用。

肾小管来源的EVs增强M1巨噬细胞极化，加重IR肾损伤

那么，TECs是如何影响巨噬细胞的呢？研究人员将目光投向了EVs。他们在IRI后的肾组织中观察到了EVs的存在，并且EVs标志物CD63、CD9等的表达随着时间推移而增加。在体外，他们从经历H/R处理的TCMK1细胞（小鼠肾小管上皮细胞系）培养基中成功分离出EVs（Hy-EVs）。这些Hy-EVs能够被Raw264.7巨噬细胞有效摄取。当用Hy-EVs处理巨噬细胞时，巨噬细胞表现出更强的M1极化倾向和更高的炎症因子分泌能力。进一步，当研究人员通过敲低Rab27a（一个调控EVs释放的关键基因）来抑制TECs的EVs分泌后，巨噬细胞的M1极化和炎症反应被显著抑制。更有趣的是，在共培养体系中，被Hy-EVs“教育”成M1表型的巨噬细胞，更能诱导TECs发生凋亡。在动物体内实验中，向IRI模型小鼠尾静脉注射Hy-EVs，会加重肾脏的M1巨噬细胞浸润、炎症反应、组织损伤和细胞凋亡。相反，使用Rab27a KO小鼠（其体内EVs分泌能力受损）则能减轻IRI后的上述病理变化。这些结果强有力地证明，TECs在缺氧应激下释放的EVs是促进巨噬细胞M1极化并加重肾IRI的重要媒介。

EV携带的miR-491-3p来自肾小管细胞，在体外增强巨噬细胞炎症极化

EVs发挥功能依赖于其携带的“货物”。为了找到关键分子，研究人员对H/R处理后的TCMK1细胞来源的EVs进行了miRNA测序。通过生物信息学分析和实验验证，他们锁定了一个名为miR-491-3p的miRNA。它在H/R处理的TECs及其分泌的EVs中含量显著升高，并且能够通过EVs被有效地传递给巨噬细胞。功能实验表明，在TECs中过表达miR-491-3p，然后收集其EVs处理巨噬细胞，会显著增强巨噬细胞的M1极化和炎症因子产生；而抑制miR-491-3p则产生相反效果。在人的肾小管细胞（HK-2）和单核细胞（THP-1）来源的巨噬细胞中也验证了这一机制的存在，提示其可能具有临床相关性。

肾TEC来源的EV携带的miR-491-3p直接靶向SIRT1并显著抑制其在巨噬细胞中的转录和蛋白表达

miRNA需要通过靶向特定的信使RNA（mRNA）来发挥功能。通过生物信息学预测和双荧光素酶报告基因、RNA Pull-down等实验，研究人员证实miR-491-3p能够直接结合并抑制巨噬细胞中SIRT1基因的3‘-非翻译区（3’-Untranslated Region, 3‘-UTR），从而降低SIRT1的蛋白表达水平。当巨噬细胞摄取携带高量miR-491-3p的EVs后，其内部的SIRT1蛋白水平确实下降了。这表明SIRT1是miR-491-3p在巨噬细胞中的直接功能靶点。

SIRT1调节巨噬细胞M1极化

那么，SIRT1本身在巨噬细胞中扮演什么角色呢？对公共数据库的单细胞RNA测序数据进行分析发现，在AKI或CKD患者的肾巨噬细胞中，SIRT1的mRNA表达显著降低。在Raw264.7巨噬细胞中过表达SIRT1，可以部分逆转脂多糖（LPS）诱导的M1极化。这表明SIRT1本身具有抑制巨噬细胞M1极化的作用。

EV携带的miR-491-3p通过SIRT1介导的NICD去乙酰化激活Notch/NF-κB信号通路，从而在体外促进巨噬细胞M1极化

通路分析提示SIRT1与Notch信号通路密切相关。进一步的实验证实，SIRT1蛋白能够与Notch信号的活性形式——Notch细胞内结构域（Notch Intracellular Domain, NICD）发生相互作用。分子对接预测了二者可能的结合位点。研究人员提出假设：miR-491-3p通过抑制SIRT1，影响了SIRT1对NICD的去乙酰化修饰。乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，会影响蛋白质的稳定性。实验结果显示，当SIRT1被抑制（通过miR-491-3p过表达或siRNA敲低）时，NICD的乙酰化水平升高，同时NICD的蛋白总量也增加了，但其mRNA水平没有变化，提示影响发生在蛋白质稳定性层面。已知E3泛素连接酶FBXW7能够识别并泛素化NICD，引导其被蛋白酶体降解。研究人员发现，升高的NICD乙酰化会阻碍FBXW7与NICD的结合，从而减少了NICD的泛素化降解，使其在细胞内积累。稳定的NICD进而激活下游的Notch信号，并协同激活经典的NF-κB炎症通路（表现为p-P65、p-IκBα增加），最终驱动巨噬细胞向M1表型极化。使用Notch信号通路抑制剂FLI-06可以阻断这一过程。

miR-491-3p通过抑制SIRT1介导的NICD去乙酰化阻止FBXW7介导的NICD泛素依赖性降解

为了直接验证NICD稳定性的变化，研究人员使用了蛋白质合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide, CHX）来追踪NICD的降解速率。结果发现，过表达miR-491-3p或敲低FBXW7，都能显著减慢NICD的降解。Co-IP实验进一步证实，miR-491-3p过表达或SIRT1敲低会减弱FBXW7与NICD之间的相互作用，并且降低了NICD的泛素化水平。这清晰地阐明了miR-491-3p→SIRT1↓→NICD乙酰化↑→FBXW7结合受阻→NICD泛素化降解减少→NICD稳定→Notch/NF-κB通路激活→M1极化的完整分子链条。

在体内，肾小管来源的EV携带的miR-491-3p可通过SIRT1/Notch轴激活NF-κB通路，促进巨噬细胞M1极化和肾IR诱导的炎症反应

最后，在动物模型上验证了这一通路。向IRI小鼠注射来自过表达miR-491-3p的TECs的EVs，会加重肾损伤，表现为肾组织SIRT1蛋白下调，NICD蛋白积累，NF-κB通路活化，M1巨噬细胞增多，炎症因子水平升高，组织病理损伤和细胞凋亡加剧。而注射来自抑制miR-491-3p的TECs的EVs，则能减轻这些损害。这有力地证明了在体內，肾小管来源的EV-miR-491-3p确实是通过调控巨噬细胞内的SIRT1/NICD/NF-κB轴来恶化肾IRI的。

研究结论与意义

本研究系统地揭示了一条全新的肾IRI发病机制：在缺血缺氧刺激下，肾小管上皮细胞释放富含miR-491-3p的细胞外囊泡；这些囊泡被巨噬细胞摄取后，其携带的miR-491-3p直接靶向并抑制SIRT1的表达；SIRT1的减少导致其介导的NICD去乙酰化作用减弱，使得NICD乙酰化水平升高；高乙酰化的NICD难以被E3泛素连接酶FBXW7识别和泛素化，从而逃避了蛋白酶体降解途径，在细胞内异常稳定和积累；累积的NICD持续激活Notch信号，并协同增强NF-κB通路活性，最终驱动巨噬细胞向促炎的M1表型极化，大量释放炎症因子，加剧肾小管细胞凋亡和肾脏组织损伤。

该研究的创新性在于首次阐明了EV-miR-491-3p作为TECs调控巨噬细胞极化的关键信使分子，并深入解析了其下游通过SIRT1介导的蛋白质去乙酰化修饰调控蛋白质稳定性，进而影响信号通路的精细机制。这不仅深化了对肾IRI中细胞间通讯和炎症反应调控的认识，也为急性肾损伤的诊断和治疗提供了新的思路和潜在靶点。例如，开发针对miR-491-3p的抑制剂（如antagomiR），或使用SIRT1激动剂，可能成为减轻肾IRI的新策略。同时，调控EVs的释放（如靶向Rab27a）也可能具有治疗潜力。尽管将基础研究发现转化为临床应用仍面临挑战（如药物的肾脏靶向递送问题），但本研究无疑为未来开发针对AKI的创新疗法奠定了重要的理论基础。