NLRP3炎症小体激活调控中性粒细胞胞外诱捕网形成并加重支气管扩张气道炎症的机制研究

《Research》：NLRP3 Inflammasome Activation Modulates Neutrophil Extracellular Trap Formation and Aggravates Airway Inflammation in Bronchiectasis

本研究针对支气管扩张中中性粒细胞炎症与铜绿假单胞菌感染导致的NLRP3炎症小体激活和NETs形成机制不明的问题，通过临床队列和体外实验揭示了LPS通过NF-κB信号启动上皮细胞炎症反应，NETs作为第二信号协同激活NLRP3炎症小体，形成恶性循环加重气道损伤。研究发现抑制PAD4可有效阻断NETs生成，为靶向治疗提供了新策略。

　　

在慢性呼吸道疾病中，支气管扩张是一种以持续性气道扩张和反复感染为特征的难治性疾病。尽管已知中性粒细胞浸润和铜绿假单胞菌感染是推动疾病进展的关键因素，但驱动气道炎症恶性循环的具体分子机制始终蒙着神秘面纱。特别是在疾病急性加重期，患者体内为何会出现更剧烈的炎症反应？中性粒细胞释放的网状结构——中性粒细胞胞外诱捕网如何与病原体协同作战，最终导致气道结构破坏？这些问题成为困扰临床医生和科研人员的难题。

为揭开这一谜团，研究团队将目光投向了免疫系统中的重要调控者——NLRP3炎症小体。这个由多种蛋白质组成的复合体如同细胞内的"警报器"，能够识别病原体信号并启动炎症反应。然而，在支气管扩张的特定环境下，这个"警报器"是如何被激活的？它与中性粒细胞胞外诱捕网之间又存在着怎样的对话？这些问题的答案可能为开发新的治疗策略提供重要线索。

研究人员设计了一项多层次的研究方案，首先从临床样本入手，比较了支气管扩张患者稳定期和急性加重期炎症指标的变化。通过收集38对配对样本，发现急性加重期患者痰液中IL-1β水平显著升高，且与血液中性粒细胞计数呈正相关。这一现象提示NLRP3炎症小体激活可能在疾病恶化过程中扮演重要角色。

在机制探索层面，团队分离患者血液中的中性粒细胞进行体外实验，证实铜绿假单单胞菌的主要毒力因子脂多糖能够有效激活NLRP3炎症小体，并诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成。特别值得注意的是，急性加重期患者的中性粒细胞即使在没有外部刺激的情况下，也表现出更高的炎症小体活性，说明这些细胞在体内已处于"预激活"状态。

研究最具创新性的发现在于揭示了病原体与宿主免疫反应的协同效应。通过建立气液界面培养系统，团队成功培养了患者来源的支气管上皮细胞，模拟体内气道环境。实验表明，脂多糖单独作用主要激活NF-κB信号通路，上调炎症因子表达，但不足以完全激活炎症小体。而当中性粒细胞胞外诱捕网作为"第二信号"加入后，与脂多糖产生协同效应，显著增强了上皮细胞中NLRP3炎症小体的活化程度，导致更严重的上皮损伤和黏液过度分泌。

在治疗策略探索方面，研究测试了多种抑制剂的作用效果。结果显示，虽然NLRP3抑制剂MCC950和 caspase抑制剂Z-VAD-FMK能够抑制炎症小体活化，但对中性粒细胞胞外诱捕网形成的阻断作用有限。而靶向肽基精氨酸脱亚胺酶4的抑制剂GSK484则能有效抑制中性粒细胞胞外诱捕网生成，且不影响炎症小体功能，这为选择性干预提供了新思路。

关键技术方法包括：收集124例支气管扩张患者临床样本进行炎症指标检测；通过Ficoll密度梯度离心分离中性粒细胞进行体外刺激实验；建立气液界面培养系统培养患者来源支气管上皮细胞；采用蛋白质免疫印迹、免疫荧光和酶联免疫吸附测定检测蛋白表达；利用转录组测序分析基因表达谱；使用特异性抑制剂进行干预研究。

研究结果

痰液IL-1β水平在急性加重期升高并与血液中性粒细胞计数和C反应蛋白相关

通过对38例支气管扩张患者的配对样本分析，发现急性加重期痰液IL-1β浓度中位数达到5,247.0 pg/ml，显著高于稳定期的2,356.1 pg/ml。同时，急性加重期患者血液中性粒细胞百分比也明显升高（71.9% vs 64.6%）。相关性分析显示，IL-1β水平与血液中性粒细胞百分比和C反应蛋白均存在显著正相关。这些结果表明IL-1β可作为区分疾病活动状态的潜在生物标志物。

血液中性粒细胞中炎症小体激活和NETs产生

研究纳入82例患者进行深入机制探索。流式细胞术分析发现，重度支气管扩张患者中性粒细胞表面标志物CD66b和CD16表达上调，而CD15表达降低，提示中性粒细胞活化状态与疾病严重程度相关。体外实验显示，脂多糖和尼日利亚霉素刺激可显著增强中性粒细胞中caspase-1 p20和IL-1β的表达，且急性加重期患者的细胞反应更为强烈。通过检测DNA-髓过氧化物酶和DNA-中性粒细胞弹性蛋白酶水平，证实急性加重期和重度支气管扩张患者的中性粒细胞胞外诱捕网形成增加，且铜绿假单胞菌定植患者表现更为明显。

LPS诱导支气管上皮细胞炎症小体前体标志物激活和中性粒细胞趋化因子产生

利用气液界面培养系统，研究人员发现脂多糖刺激可上调支气管上皮细胞中NLRP3、IL-1β等炎症相关基因表达，并激活NF-κB信号通路。转录组测序结果显示，脂多糖处理后上皮细胞多种中性粒细胞趋化因子基因显著上调，包括CXCL1、CXCL2、CXCL6和CXCL8，这为中性粒细胞向气道募集提供了分子基础。

LPS+NETs共刺激诱导组织损伤、黏液高分泌和上皮炎症小体激活

实验表明，中性粒细胞胞外诱捕网单独处理可引起上皮细胞纤毛减少和紧密连接破坏，而与脂多糖共同刺激时，这些损伤效应更为显著。免疫荧光显示黏液蛋白MUC5AC表达明显增加。在分子水平上，共刺激显著上调了上皮细胞中NLRP3炎症小体相关组分表达，并促进IL-1β成熟释放，表明中性粒细胞胞外诱捕网确实可作为第二信号充分激活上皮炎症小体。

炎症小体特异性抑制剂消除中性粒细胞炎症小体激活但不影响NETs形成

药物干预实验显示，MCC950和Z-VAD-FMK能有效抑制中性粒细胞中IL-1β成熟，但对中性粒细胞胞外诱捕网形成的抑制作用有限。而GSDMD抑制剂LDC7559和disulfiram对NETs的抑制效果不一致，PAD4抑制剂GSK484则能显著减少中性粒细胞胞外诱捕网形成而不影响炎症小体活性。

研究结论与意义

本研究系统阐明了支气管扩张中NLRP3炎症小体激活与中性粒细胞胞外诱捕网形成的相互作用机制。铜绿假单胞菌脂多糖通过激活NF-κB信号启动上皮细胞炎症反应，招募中性粒细胞并促进其释放中性粒细胞胞外诱捕网；这些网状结构反过来作为第二信号，与病原体协同激活上皮炎症小体，形成恶性循环，加剧气道炎症和组织损伤。

该研究的创新点在于首次揭示了中性粒细胞胞外诱捕网在支气管扩张炎症放大回路中的关键作用，并提出了"双信号激活"模型。在治疗策略方面，研究发现靶向PAD4可能比直接抑制炎症小体更能有效控制中性粒细胞胞外诱捕网相关病理损害，这为开发精准治疗方案提供了新方向。

研究结果不仅深化了对支气管扩张发病机制的理解，也为其他中性粒细胞相关慢性气道疾病的治疗提供了借鉴。通过干预NLRP3炎症小体激活和中性粒细胞胞外诱捕网形成的交叉对话，可能为打破炎症恶性循环、改善患者预后开辟新的治疗途径。