微量肉汤稀释法的革新：降低MIC检测体积的成本与环境效益分析

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Optimizing antimicrobial susceptibility testing: cost and environmental benefits of MIC volume reduction

本文系统评估了将微量肉汤稀释法（BMD）检测体积从标准100-200 μL降至30 μL的可行性。研究表明，在水分饱和环境下，除米卡芬净（micafungin）对酵母菌外，缩小体积后的最低抑菌浓度（MIC）测定结果与EUCAST/CLSI标准高度一致，且能显著降低试剂消耗（尤其是昂贵抗生素如cefiderocol）和塑料废弃物（减少69.3%），为高通量药物筛选和资源有限的研究场景提供了可靠方案。

　　

ABSTRACT

最低抑菌浓度（MIC）的测定是评估抗菌药物效价、指导临床治疗决策和药物研发的关键环节。标准微量肉汤稀释法虽被广泛采用，但所需试剂体积较大，在测试新型或昂贵抗菌药物时存在限制。本研究评估了在保持MIC准确性的前提下缩小检测体积的可行性。通过比较标准96孔板（100 μL和200 μL）与384孔板（30 μL和50 μL）对多种ATCC革兰阴性菌、革兰阳性菌及酵母菌的MIC测定结果，发现除米卡芬净对酵母菌外，缩小体积后的MIC值均符合EUCAST和CLSI定义的允许变异范围。进一步在30 μL体积下对30株革兰阴性临床分离株进行验证，结果一致性良好。针对小体积实验中易发的蒸发问题，研究通过在水饱和气氛中孵育予以有效控制。体积缩小还显著降低了材料成本和抗菌药物消耗量。这种微型化方案为抗菌药物敏感性试验提供了一种经济高效的高通量替代路径，尤其适用于化合物获取受限或成本高昂的研究场景。

INTRODUCTION

MIC定义为完全抑制微生物可见生长的最低抗菌药物浓度，其测定对评估抗菌效价、指导临床用药和新药研发具有核心意义。微量肉汤稀释法因其准确性、可重复性及实验室易操作性，被EUCAST和CLSI认定为金标准方法。该方法通常在96孔微孔板中进行，可同步测试多个抗生素或抗真菌药物浓度，为已知或新型化合物提供全面的抗菌谱。尽管临床实验室已实现自动化操作，但研究型微生物学实验室仍多采用手动方式。根据CLSI或EUCAST建议，该方法通常在100 μL至200 μL终体积下进行，符合ISO 20776-1标准。

虽然该方法在培养基、接种菌量、孵育时间和温度方面已高度标准化，但在小体积条件下（尤其在测试新合成分子或使用昂贵培养基时）的可靠性和可重复性仍需验证。缩小体积不仅能节约资源（减少塑料消耗），还可提升实验效率、降低成本和增加通量，对开展大规模抗菌药物筛选或药物研发高通量研究的实验室尤为有利。

本研究通过比较不同终体积（200 μL、100 μL、50 μL和30 μL）在两种微孔板（96孔和384孔）中对5种细菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌）及2种酵母菌（克柔念珠菌和近平滑念珠菌）的MIC测定结果，评估体积缩小对MIC值的影响。同时针对微型化带来的蒸发问题，通过水饱和环境孵育进行控制，并在10株临床分离株中验证了小体积MIC评估的一致性。

MATERIALS AND METHODS

Strains used

研究使用的参考菌株包括：铜绿假单胞菌ATCC 27853、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 43816、鲍曼不动杆菌ATCC 19606、克柔念珠菌ATCC 6258和近平滑念珠菌ATCC 22019。另从铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中各选取10株具有不同耐药谱的临床分离株。

Antibiotics and reagents

阿米卡星和庆大霉素分别购自Thermo Fisher Scientific和Carl Roth。两性霉素B、氨曲南、头孢他啶、环丙沙星、氟康唑、利奈唑胺、美罗培南和米卡芬净购自Sigma-Aldrich。头孢地尔（cefiderocol）由Shionogi以Fetroja商品名提供。

培养基包括Sigma-Aldrich的阳离子调节MHB 2（Ca-MHB）和RPMI 1640（含L-谷氨酰胺、pH指示剂，添加2%葡萄糖并用0.165 mol/L MOPS缓冲至pH 7.0）。铁耗竭MHB（ID-MHB）根据EUCAST建议自制，经ICP-MS检测铁离子浓度为8.29 μg/L。

Evaluation of evaporation

为评估蒸发影响，将不同终体积的Ca-MHB加入孔板，在空气气氛或水饱和气氛中37°C静置孵育24小时（不添加细菌）。通过转移孔内液体至微量管并精密称重，计算剩余体积百分比。每个实验重复三次。

MIC in microdilution

MIC测定遵循标准指南，具体调整如下：

为评估气氛影响，在100 μL终体积下比较空气与水饱和气氛中5种细菌的MIC值（条件A）。

为评估体积缩小影响，使用96孔板（100 μL和200 μL）和384孔板（30 μL、50 μL和100 μL）在水饱和气氛中测试。每个条件至少进行三次独立实验，每次设三个复孔。MIC值与EUCAST QC Tables 14和AFST QC v7.0中的预期范围进行比对。

细菌实验在Ca-MHB（头孢地尔使用ID-MHB）中进行，最终接种量为5×10⁵ CFU/mL，37°C孵育16–20小时后读取结果。酵母菌实验在补充RPMI 1640中进行，接种量为0.5–2.5×10⁵ CFU/mL，37°C孵育24小时。为减少终点判读难度，采用肉眼观察和酶标仪（Tecan Infinite M200）测OD值的双读法。

RESULTS

Impact of the incubation atmosphere on evaporation of the medium

蒸发比较显示，在空气气氛中，96孔板角落孔仅剩余72±2%体积，边缘孔剩余90%以上，中间孔无体积损失。而在水饱和气氛中，所有孔体积保持稳定（24小时后仍为100%）。

在384孔板（30 μL终体积）中，蒸发效应更显著：角落孔仅剩42±5%，边缘孔剩余57±4%至73±3%，而第三列及以后孔体积接近100%。水饱和气氛下所有孔体积保持90%以上。为控制蒸发，后续实验均在水饱和气氛中进行。

Impact of the incubation atmospheres on MIC values in 100 μL final volume

比较100 μL终体积在两种气氛中的MIC值，91.9%（114/124）的测量值落在可接受的±1 log₂稀释倍数范围内，仅8.1%（10个值）超出±2 log₂稀释倍数范围，表明水饱和气氛不影响MIC测定。

Impact of the volume reduction on MIC values

针对多种细菌和酵母菌及不同抗菌药物的MIC测定显示，缩小体积至30 μL后，66.4%（150/222）的MIC值与标准体积完全一致，24.3%（54/222）存在±1 log₂稀释倍数差异（累计90.7%落在可接受范围），7.2%（16/222）存在±2 log₂稀释倍数差异，仅两个值差异超过±2 log₂稀释倍数。

铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的MIC值在不同体积下均无显著差异，且全部落在EUCAST质控菌株的预期范围内。酵母菌实验中，两性霉素B和氟康唑的MIC值在不同体积下稳定，但米卡芬净在小体积（30 μL和50 μL）中MIC值倾向于升高1–2个稀释倍数，可能与药物易吸附于塑料的特性有关。其他革兰阴性菌（大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌）对阿米卡星、环丙沙星和美罗培南的MIC值也未见体积影响。

Validation on clinical isolates

对30株临床分离株（铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌各10株）的MIC测定表明，93.6%（103/110）的测量值在标准体积与30 μL体积间差异不超过±1 log₂稀释倍数，且无药敏类别（敏感/耐药）转换发生。

Reducing volume is associated with cost savings

体积缩小至30 μL后，对常用抗菌药物可节约约15%成本，而对头孢地尔等昂贵药物（使用ID-MHB）成本降低可超过25%。微型化还减少塑料消耗达69.3%，具有显著环境效益。

DISCUSSION

通过缩小检测体积优化MIC测定条件是提升研究效率的关键策略。本研究证实，将终体积降至30 μL对多数抗菌药物（除米卡芬净外）的MIC值无显著影响，且通过水饱和气氛孵育可有效控制蒸发偏倚。

The evaporation is more pronounced with small volume but can be counteracted in a water-saturated atmosphere

小体积实验需关注蒸发问题，尤其在384孔板边缘孔。水饱和气氛可基本消除蒸发影响，且不影响MIC测定准确性。

Reducing the volume of experiments does not significantly influence MIC values

多数MIC值落在可接受范围内，表明体积和板型对测定无实质影响。但米卡芬净因易吸附塑料表面，小体积中MIC值可能偏高，提示对该类药物需谨慎选择体积条件。

To reduce the volume of experiments and reduce materials needed and cost of the experiments

体积缩小可显著降低试剂成本（尤其对高价药物和特殊培养基）和塑料废弃物，同时提升高通量能力。相比其他微型化方法（如微毛细管设备或单细胞成像），本研究方案更贴近EUCAST/CLSI标准，且避免了接种量效应等潜在偏倚。

Potential limitations of reduced-volume MIC testing

体积过小（如20 μL）可能因移液精度限制降低重现性；384孔板操作通常需自动化系统和灵敏读板器支持；某些药物终点判读难度增加，建议结合双读法确保准确性。总体而言，缩小体积为有限资源下的抗菌药物筛选提供了可行路径。

ACKNOWLEDGMENTS

感谢Agnès Audurier的技术支持及Jeffrey Arsham的语言修订。本研究由ANR项目Seq2DiAg（ANR-20-PAMR-0010）资助。