新兴碳青霉烯耐药埃尔托型霍乱弧菌O1的基因组特征与传播风险研究

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Genomic portrayal of emerging carbapenem-resistant El Tor variant Vibrio cholerae O1

本文系统揭示了印度古吉拉特地区分离的碳青霉烯耐药（CR）霍乱弧菌O1埃尔托变体的分子流行病学特征，发现其携带可水平传播的IncA/C型质粒（含blaNDM-1等耐药基因），凸显了耐药基因在肠杆菌科中扩散的潜在公共卫生危机。

　　

ABSTRACT

碳青霉烯耐药（CR）肠病原体的流行对公共卫生管理和抗菌治疗构成严峻挑战。虽然碳青霉烯耐药在霍乱弧菌O1（VC）中罕见，但近期CR菌株的出现预示其耐药性（AMR）格局的重大转变。本研究旨在表征2019年印度古吉拉特霍乱患者中分离的新兴埃尔托型CRVC的耐药机制。通过Kirby-Bauer纸片扩散法和最低抑菌浓度（MIC）测定50株VC分离株的耐药表型，并结合全基因组测序（WGS）解析CR的分子基础。所有菌株均携带海地型高毒力等位基因（如ctxB、tcpA），且呈现典型多位点耐药（MDR）特征。值得注意的是，12%（6/50）的菌株对碳青霉烯及其他抗生素耐药。分子分析显示这些CR菌株为克隆相关，并携带一个142 kbp的IncA/C型接合型大质粒，其上聚集了bla_NDM-1等AMR基因。该质粒可高效转移至大肠杆菌、副溶血弧菌、志贺氏菌等其他肠道病原体，并赋予受体菌与供体一致的耐药表型。质粒的水平基因转移（HGT）能力极大增加了CRVC扩散风险，可能严重冲击霍乱治疗方案。本研究强调需加强基因组监测和抗菌药物管理，以遏制CRVC传播。

INTRODUCTION

霍乱仍是全球重大健康威胁，尤其在卫生条件差、人口密集及洪涝灾害频发地区。其致病主因为摄入被产毒型革兰阴性菌霍乱弧菌O1或O139污染的水或食物。历史上，古典生物型引发前六次霍乱大流行，而当前第七次大流行（7P）由1961年出现的埃尔托生物型主导。该型菌株通过表型和遗传变异增强毒力、耐药性及传播力，导致全球报告超53万病例及4000余死亡。近年来，VC O1对广谱抗菌药物（如氨苄西林、环丙沙星、四环素、大环内酯类、喹诺酮类、复方新诺明乃至碳青霉烯类）耐药性日益严重。多项研究指出MDR VC O1埃尔托型的出现与基因突变、可移动遗传元件（MGEs）获取及外排泵机制相关。2019年也门VC分离株对大环内酯类和三代头孢耐药，且与携带20 kb伪复合转座子的139 kbp IncC质粒相关，提示HGT的存在。过去十年中，VC对环境DNA（eDNA）的捕获能力及HGT特性使其成为ARGs的潜在储库。尽管碳青霉烯非霍乱首选药物，但VC中CR现象警示其可能通过质粒传播威胁其他肠道病原体治疗。

RESULTS

Phenotypic and molecular characterization of V. cholerae

所有VC分离株均为O1血清群Ogawa血清型，VP试验产乙酰甲基羧醇，血平板显示溶血性，与埃尔托参考株N16961一致，但对多黏菌素B（PB）敏感类似古典型O395。毒力基因谱显示均携带海地型高毒力等位基因（ctxB、tcpA、rtxA）。药敏试验显示多数菌株为MDR（耐3类以上药物），全部耐链霉素和复方新诺明，但对四环素、诺氟沙星、氧氟沙星、阿奇霉素、多西环素敏感。96%耐萘啶酸，氯霉素（76%）和环丙沙星（12%）敏感性降低。6株CRVC（AKM-1至AKM-6）对氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、庆大霉素、美罗培南耐药，其MIC值显著升高（美罗培南4–16 mg/L，氨苄西林、头孢曲松、庆大霉素均>256 mg/L）。PCR证实6株均携带bla_NDM-1。

WGS analysis of CRVC

WGS显示CRVC属于ST-69型，基因组约4 Mb，GC含量47.6%。携带多种ARGs：β-内酰胺类耐药基因（bla_NDM-1、bla_CMY-6、bla_DHA-7），氨基糖苷类耐药基因（strA、strB、rmtC、aac(6')-Ib3），磺胺类及甲氧苄啶耐药基因（sul1、sul2、dfrA1），氯霉素耐药基因（floR、catB9）。表型与基因型耐药高度一致，且ARGs多与MGEs（质粒、插入序列、转座子）关联。

Phylogenetic clustering of the CRVC in the global context

基于427株VC基因组的核心SNP系统发育分析显示，CRVC（AKM-1至AKM-6）形成独立簇，与印度既往菌株亲缘近。受体VC（AKM-7）及其接合子（AKM-8）虽聚为一支，但明显区别于CRVC簇，表明其遗传背景差异。接合实验未引起染色体SNP变异，提示质粒转移未立即引发宿主基因组适应性突变。

Characterization of the IncA/C plasmid carrying bla_NDM-1

质粒pNDM-VC大小约142 kb，GC含量51.4%，含174个CDSs，属IncA/C ST-1型。其携带ARGs包括bla_NDM-1、bla_CMY-6、bla_DHA-7、aph(3')-VI、aph(3")-Ib、aph(6)-Id、aac(6')-Ib3、rmtC、sul1、ble_MBL。ARGs分布于两个区域：其一位于IS26与I类整合子3′保守序列间，含sul1至qacE基因簇及traGH接合转移基因；其二含bla_CMY-6，侧翼为tnpA转座酶和IV型分泌系统（T4SS）基因簇。

Comparative analysis of IncA/C plasmids revealed a diverse genetic background for bla_NDM-1

比较基因组显示pNDM-VC与大肠杆菌（KC999035）和VC（CP007636）质粒高度相似（99% identity）。不同VC质粒的ARGs组合差异显著，如部分携带ESBLs和AMEs但无bla_NDM。bla_NDM周边遗传环境在普罗威登斯菌、VC、大肠杆菌、克雷伯菌中高度保守，提示该元件在菌种间水平转移并稳定维持。

Transmission ability of the bla_NDM-1-carrying IncA/C plasmid through conjugation

接合实验证实质粒可转移至所有测试受体（大肠杆菌J53、副溶血弧菌、志贺氏菌、VC O1、沙门氏菌）。接合子均获得对氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、美罗培南、庆大霉素耐药性，且质粒大小与供体一致。转移频率依次为：大肠杆菌J53（2.9 × 10^?2）>副溶血弧菌（1.22 × 10^?3）>志贺氏菌（2.35 × 10^?4）>VC O1（1.4 × 10^?5）>沙门氏菌（1.42 × 10^?6）。

DISCUSSION

AMR的进化显著影响VC流行病学。埃尔托型VC通过获取MGEs发展为MDR甚至广泛耐药（XDR）病原体。2012年印度南部首次报道携带bla_NDM-1的CRVC，此后CRVC在孟加拉国、尼日利亚、乌干达、南非等多地出现。本研究菌株呈现埃尔托生物型PB敏感表型，携带海地型毒力基因（ctxB7、tcpA^CIRS），且对四环素敏感，但CRVC通过IncA/C质粒获得碳青霉烯耐药性。系统发育证实CRVC为ST-69型克隆扩散，质粒接合未引起宿主基因组突变，但长期传代可能引发适应性进化。IncA/C质粒可逃逸CRISPR-Cas系统，进一步增强其持久性。CRVC的出现亟需通过基因组监测、抗菌药物管理及感染控制措施遏制其传播。