日本地区医疗环境中产IMP型碳青霉烯酶阴沟肠杆菌复合体高风险克隆的扩散

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：High-risk clonal expansion of IMP-producing Enterobacter cloacae complex in regional Japanese healthcare settings

本研究通过基因组学分析揭示了日本地区医院中产IMP型碳青霉烯酶阴沟肠杆菌复合体（CPEC）的传播动态，发现ST78和ST133两大高风险克隆（特别是以往认知不足的ST133型）的广泛分布。研究强调在资源有限的小型医院开展分子监测的重要性，为耐药菌防控提供了关键流行病学依据。

　　

ABSTRACT

碳青霉烯酶阴沟肠杆菌复合体（CPEC）已成为医疗环境中的新兴威胁，但其在地区和地方医院间的传播机制尚不明确。2014年至2022年间，从日本14个都道府县的58家医院收集了211株对碳青霉烯类药物敏感性降低的阴沟肠杆菌复合体（ECC）非重复分离株。PCR检测显示，92.9%的分离株携带bla_IMP-1群基因。对其中的80株代表性CPEC分离株进行全基因组测序分析，发现两个主要的高风险克隆群ST78和ST133（包括其单一位点变异型）占测序分离株的62.5%。值得注意的是，ST133型在日本此前极少报道，但本研究中却是第二常见的类型，且分布广泛，提示其存在渐进且不易察觉的传播。ST78型表现出显著的基因组多样性、频繁共携带超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因以及多种质粒复制子；而ST133型则形成一个更为均一的谱系，其耐药决定簇有限。大多数分离株对阿米卡星和头孢地尔保持高度敏感。核心基因组多位点序列分型（cgMLST）分析提示，在某些医院中，亲缘关系密切的菌株（等位基因差异≤10个）可能存在院内持续存在和院际传播。在46家检出bla_IMP-1群阳性分离株的医疗机构中，73.9%（34/46）为小型医院（床位数<200张）。在筛查的ECC分离株中，bla_IMP-1群阳性比例在小型和大型医院中均较高（90.5% vs 94.8%），无显著差异，这表明有必要将分子监测范围扩展到资源有限的医疗环境。这些发现凸显了分子确认和靶向基因组分析的实用性，特别是在高风险CPEC克隆可能未被察觉而传播的地区或环境中，有助于支持及时检测和防控工作。

INTRODUCTION

阴沟肠杆菌复合体（ECC）是医疗环境中普遍存在的革兰氏阴性兼性厌氧菌，是重要的机会性病原体。ECC常引起医院感染，包括血流感染、呼吸道感染、尿路感染和手术部位感染。尽管在全球范围内，肺炎克雷伯菌在耐碳青霉烯类肠杆菌目（CRE）中占主导地位，但ECC由于其内在耐药性和通过移动元件获得碳青霉烯酶基因的能力，近年来已成为CRE的主要贡献者。虽然在世界其他地区，肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）、新德里金属β-内酰胺酶（NDM）和OXA-48样酶是主要的碳青霉烯酶类型，但日本的特点是广泛存在亚胺培南酶（IMP）型金属β-内酰胺酶，约占全球检出率的25%。在日本，bla_IMP-1最为流行，而bla_IMP-6在某些地区也很常见。产IMP型ECC是日本主要的碳青霉烯酶威胁，这限制了治疗选择并恶化了临床结局。尽管自2014年起日本已开展全国性的CRE监测，但对碳青霉烯酶阴沟肠杆菌复合体（CPEC）的分子流行病学研究主要集中在三级和大学医院，这些机构由于在患者转诊网络中处于核心位置，面临CRE传入和传播的风险较高。

在全球范围内，社区医院和长期急性护理医院是碳青霉烯酶肠杆菌目（CPE）长期定植和隐匿传播的已知储存库，然而来自日本此类环境的分子数据仍然匮乏。数学模型表明，CRE传播受患者流动和机构间网络（包括非三级医院）的影响，凸显了它们在区域传播中的关键作用。

为弥补这一知识空白，我们开展了针对日本地方和地区医院ECC分离株的区域分层基因组分析，以表征CPEC克隆谱系和耐药谱，为制定靶向感染控制策略提供信息。

RESULTS

Characteristics of collected ECC isolates

共收集211株经自动化药敏系统（日本CRE标准：美罗培南最低抑菌浓度（MIC）≥2 μg/mL 或 亚胺培南MIC≥2 μg/mL 且 头孢美唑MIC≥64 μg/mL）提示的ECC非重复分离株（每名患者一株，优先选择血培养分离株），这些分离株来自14个都道府县的58家地方或地区医院（不包括大学附属医院、精神病院和长期护理机构）。在211株筛查的ECC分离株中，最常见的标本类型是下呼吸道（79株，37.4%），其次是尿液（56株，26.5%）、上呼吸道（24株，11.4%）、血液（23株，10.9%）和导管尖端样本（8株，3.8%）。其余21株（10.0%）来自其他标本类型，包括脓肿、腹水、粪便、胆汁和胸水。为评估所有211株ECC分离株是否存在碳青霉烯酶基因，我们使用PCR对每株分离株进行筛查；总体而言，196/211株（92.9%）为bla_IMP-1群阳性。

Whole-genome sequencing and multi-locus sequence typing analysis: species identification, sequence types, and molecular profiles

在196株经PCR确认为bla_IMP-1群阳性的分离株中，选择每个机构每年一株代表性菌株（n = 80）进行全基因组测序（WGS）。草稿组装的平均覆盖度为128倍，中位contig数为108个，中位N50为253,091 bp，平均基因组大小为5,162,981 bp，平均鸟嘌呤-胞嘧啶含量为54.9%，平均每个分离株有4,907个编码序列。

通过平均核苷酸一致性（ANI ≥95%）进行物种鉴定，揭示了多种肠杆菌属物种，最常见的是香坊肠杆菌和霍夫曼肠杆菌。多位点序列分型（MLST）鉴定出ST78（n = 25）和ST133（n = 21）为优势型别；包括其单一位点变异型，扩展的ST78群（n = 27）和ST133群（n = 23）共同占80株分离株的50株（62.5%）。其他检测到的物种包括阿斯伯里肠杆菌、布干达肠杆菌、成都肠杆菌和未分类的肠杆菌属物种。

WGS进一步揭示了ST特异性的耐药基因和质粒复制子谱。bla_IMP-1存在于93.8%的分离株中（两株四国地区的ST78分离株携带bla_IMP-6）。超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因在ST78群（37.0%）和其他STs群（16.7%）中常见，但在ST133群中缺失（校正后P = 0.0024，与ST78群相比；P = 0.0184，与其他STs群相比）；大多数ESBL阳性的ST78群分离株共携带IncHI2和至少一个额外的质粒复制子，尽管具体组合各异。ST78群携带bla_ACT-5，而ST133群则一致携带bla_ACT-7。多复制子质粒在ST78群（55.6%）和其他STs群（66.7%）中的出现频率显著高于ST133群（0%；校正后P < 0.0003）；其他STs群还具有独特的Inc类型（如IncR、IncU和IncX10）。

Antimicrobial susceptibility of bla_IMP-1 group-positive ECC isolates

为确保标准化药敏试验，随后使用肉汤微量稀释（BMD）法对这196株CPEC分离株进行重新评估，并根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）M100折点判读药敏结果。尽管携带碳青霉烯酶基因，但大部分分离株仍对碳青霉烯类药物敏感，其中84.7%对亚胺培南敏感，83.7%对美罗培南敏感。在196株分离株中，153株（78.1%）经BMD法判定为同时对亚胺培南和美罗培南敏感。值得注意的是，这153株分离株中有9株（5.9%）表现出美罗培南MIC ≤0.125 μg/mL。

关于对非碳青霉烯类药物的敏感性，大多数分离株对多粘菌素、阿米卡星和头孢地尔表现出高度敏感性。对经WGS确认携带bla_IMP-1的CPEC分离株进行亚组分析，重点关注ST78群（n = 25）和ST133群（n = 22）。两组对这些药物均表现出相同的敏感性。然而，ST133群分离株对氟喹诺酮类药物的敏感性显著高于ST78群（左氧氟沙星：68.2% vs 0%；环丙沙星：63.6% vs 0%；P < 0.0001）。ST133和ST78分离株对甲氧苄啶-磺胺甲恶唑（77.3% vs 48.0%）或替加环素（81.8% vs 72.0%）的敏感性无统计学显著差异。在196株分离株中，仅有一株对头孢地尔耐药。

Clinical and epidemiological characteristics of ECC harboring bla_IMP-1 group isolates and associated healthcare facilities

携带bla_IMP-1群的ECC分离株在79.3%（46/58）的受调查机构中被检出，其中73.9%（34/46）为床位数<200张的小型医院。bla_IMP-1群阳性机构的平均床位数为174.6张，中位数位145张。按医院规模（<200张床位 vs ≥200张床位）分层分析，筛查的ECC中bla_IMP-1群阳性分离株的比例同样很高（90.5% vs 94.8%），且无显著差异（P = 1.00，Fisher精确检验）。

仅7号医院一家就贡献了196株CPEC分离株中的88株（44.9%）。使用四分位距（IQR）法，确定了三家高负担医院（编号7、14和37）为异常值，它们共同贡献了所有bla_IMP-1群阳性分离株的63.8%（125/196）。14号和37号医院是小型医院（床位数<200张），表明CPEC分离株的高检出并不仅限于大型机构（≥200张床位）。相比之下，其余43家机构报告的病例数要少得多，在8年监测期内，平均每家机构仅有1.65株分离株。

Regional distribution of major STs among CPEC isolates

在所有区域中，ST78和ST133群的菌株水平和机构水平频率相似，经Bonferroni校正后无显著差异，表明高风险克隆分布均匀。当将分析限制在测序分离株数≥10株的区域（东北、关东[东京]、九州）以确保统计效力时，在菌株水平上，ST133群在东北地区的出现频率显著高于东京（P = 0.0119），而在机构水平上未观察到显著差异。

Genomic surveillance and transmission dynamics of high-risk CPEC clones in local and regional healthcare settings

在46家受调查机构中，有9家（19.6%）出现了同一ST在多个年份被重复检出的情况，涉及ST78（四家机构）、ST133（三家机构）和其他ST群，如ST175和ST742（两家机构）。ST78和ST133群之间的复发比例无显著差异（P = 1.00，Fisher精确检验）。

核心基因组多位点序列分型（cgMLST）基于等位基因的分析阐明了潜在的传播模式。在ST78群阳性机构中，有三家医院（编号14、15和37）随时间推移反复鉴定出基因相关的菌株（cgMLST等位基因差异≤10个），表明可能存在院内传播。一些机构也显示出被基因不同的谱系所替代，符合克隆更替的情况。相比之下，在福岛县的7号医院，ST133分离株从2016年到2018年保持基因相关，甚至在2019年之后，仍检测到等位基因差异相对较小的菌株。在福冈（41号医院），一株ST133群（ST3243）分离株与邻近佐贺县（43号医院）的一株ST133群（ST3243）分离株等位基因差异≤10个。尽管大多数ST类别都携带bla_IMP-1，但质粒谱、ESBL基因携带情况和系统发育结构的显著差异表明其存在不同的进化和传播动力学。

DISCUSSION

本研究中，对基于日本国家CRE标准使用自动化系统筛查出的211株ECC分离株进行PCR检测，在196株分离株中检测到bla_IMP-1群基因。对代表性分离株的WGS分析揭示了高风险克隆群的优势地位，并有证据表明在某些医院中存在克隆持续性。

对代表性分离株的WGS鉴定出两个主要的国际高风险克隆ST78（霍氏肠杆菌）和ST133（香坊肠杆菌）。ST78是一个与多重耐药和医院适应相关的全球传播谱系，并在日本引起过产IMP型ECC的暴发。ST133在全球或日本国内均极少报道，尽管先前有报道称其在感染模型中显示出与铁载体相关的超强毒力。尽管先前报道有限，ST133在本研究中作为一个重要谱系出现，表明其可能比之前认为的更为广泛。其在同一家医院多年反复被检出提示了克隆持续存在和先前未被识别的渐进式传播。这些发现强调了ST78和ST133的流行病学相关性，凸显了需要进行更广泛地理范围的基因组监测以监控高风险CPEC谱系。

ST78群中ESBL基因的富集以及频繁共携带多种质粒复制子，表明该克隆可能获得了额外的耐药机制，增强了其在医院环境中抗菌药物压力下持续存在或传播的能力。这种遗传谱的对比突出了两个克隆之间选择压力或进化途径的潜在差异。除了ESBL基因，ST78群菌株一致表现出对氟喹诺酮类抗生素的耐药性。其他机制，如gyrA和parC喹诺酮耐药决定区突变、质粒介导的喹诺酮耐药基因以及外排泵的过度表达，也可能导致这种表型，值得进一步研究。

尽管存在这些差异，所有分离株，无论ST型别，均对阿米卡星、多粘菌素、替加环素和头孢地尔保持高度敏感。我们的头孢地尔结果与报告约99.2%的IMP型肠杆菌目分离株敏感的国家数据一致。头孢地尔耐药可能与cirA突变有关，尽管需要进一步研究这些机制。

当前美国感染病学会（IDSA）指南推荐使用头孢他啶-阿维巴坦联合氨曲南或头孢地尔治疗金属β-内酰胺酶（MBL）生产者。这种尽管不常发生但正在出现的耐药性，凸显了对头孢地尔敏感性进行持续分子监测的必要性，以便治疗能够迅速适应不断变化的耐药格局。

在日本，医疗系统作为一个分层网络运行，包括高级急性期护理中心（如大学附属大型专科医院）和众多中小型地方机构。患者根据临床需求和疾病严重程度频繁在机构间转移，这促进了适当的护理，同时也增加了耐药微生物（特别是CRE）在机构间传播的可能性。此外，虽然活动性CRE感染需要上报并接受公共卫生监督，但定植状态无需上报，并且处理无症状携带者的政策因机构而异。尽管存在官方的CRE感染控制建议以及国家抗菌药物管理指南，但其实施情况可能在机构间存在显著差异，可能由于感染控制资源的差异，尤其是在较小或非三级医院中。大部分医疗机构被归类为床位数少于200张的小型医院，而在本研究中，大多数受调查机构也属于此类。尽管小型医院通常报告的CPEC病例较少，但其有限的感染控制能力可能增加其作为耐药微生物储存库的脆弱性。在实践中，本研究中小型医院比例较高的一个促成因素可能是由于内部资源有限而将微生物检测外包。尽管先前的研究描述了在大型三级中心中长期、低频率传播的克隆相关CRE/CPE，我们的系统发育分析将这一观察扩展到小型医院，显示出类似的不频繁但持续的克隆传播模式。这些发现凸显了基因组分析作为监测工作的补充工具，以区分克隆持续存在与重复引入的重要性。为了在分散的医疗网络中抑制高风险克隆的传播，感染控制策略不仅需要根据医院规模进行调整，还需要根据每个机构的具体风险状况进行定制。基因组和流行病学数据的联合分析已经证明了其在阐明复杂传播途径和在医院感染暴发期间实现及时、靶向干预方面的效用。在资源有限的小型医院，利用外部指导实施标准化监测和教育项目，可能会提高感染控制措施的有效性。

检测产IMP-1型ECC仍然复杂，特别是由于基因型耐药与表型敏感性之间偶尔存在不一致，这意味着一些分离株尽管携带耐药基因，但可能表现为对碳青霉烯类药物敏感。尽管自动化药敏系统可能在某些情况下高估碳青霉烯类耐药性，但类似的差异先前已有报道。在本研究中，几株bla_IMP-1群阳性分离株通过BMD法测定显示出低的美罗培南MIC（≤0.125 μg/mL），这凸显了单纯表型筛查的局限性，因为即使低MIC也可能无法排除碳青霉烯酶的产生。日本CRE定义在2025年4月的修订版现在允许通过美罗培南MIC ≥2 μg/mL 或 美罗培南纸片抑菌圈直径≤22 mm进行确认，或者 alternatively 通过分子/免疫层析方法进行确认。然而，选择用于确认试验的分离株的实用标准仍不明确。在已知产IMP-1型ECC流行的地区，即使对于低美罗培南MIC的分离株，也可能需要进行分子确认。这强调了了解当地流行病学以指导适当诊断策略的重要性。

本研究存在一些局限性。首先，选择代表性分离株是为了涵盖区域和时间多样性；然而，罕见的STs和来自以大阪为中心的近畿地区（该地区bla_IMP-6流行）的分离株未被纳入；因此，我们的发现可能不能完全推广到全国范围。其次，缺乏患者层面的临床数据，包括病房间的流动和临床结局，使我们无法区分感染和定植，也限制了我们重建精确传播途径的能力。第三，我们基于PCR的筛查仅限于主要的碳青霉烯酶基因，可能漏掉了不常见的变异或非酶促耐药机制，如孔蛋白丢失和AmpC过表达；基因组草稿组装的缺口也可能掩盖了某些遗传元件，如抗菌药物耐药基因、可移动遗传元件或质粒复制基因。最后，来自一家高负担机构的分离株比例过高，以及各医院参与率不一（一些医院因病例数较多而贡献了更多分离株），可能引入了抽样偏倚并影响了观察到的ST分布。尽管我们纳入了来自受调查区域的所有符合筛查标准的非重复ECC分离株，但我们的发现可能不能完全代表日本全国的CPEC流行病学情况。尽管存在这些局限性，本研究代表了日本产bla_IMP-1型ECC的一次全面基因组分析。未来的研究应扩大地理覆盖范围，纳入临床和流行病学数据，并研究质粒传播以指导感染控制。

总之，这些发现强调了像ST133这样的高风险CPEC克隆在分散环境中隐匿传播的可能性，强调了将分子诊断和基因组监测整合到CRE防控工作中的重要性。