时序分布转染优化AAV2和AAV2/8衣壳填充并揭示组装时序差异

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Chronologically distributed transfection improves AAV2 and AAV2/8 capsid filling and reveals assembly schedule divergence

本研究针对腺相关病毒（AAV）基因治疗载体空衣壳比例高、生产效率低的问题，通过系统设计时序分布转染策略，发现RepCap质粒延迟递送（T1转染Helper+Payload，T2转染RepCap）可显著提升AAV2和AAV2/8衣壳填充效率约7.5倍，验证了衣壳组装与基因组复制时序错位（TMA）假说，为基因治疗生产工艺优化提供了新思路。

　　

腺相关病毒（AAV）作为基因治疗的核心工具，因其安全性高、长期表达特性备受青睐。然而，重组AAV生产过程中普遍存在空衣壳比例过高的问题，有时甚至超过总病毒颗粒的90%。这些空衣壳不仅占用生产资源、增加下游纯化难度，还可能通过竞争细胞受体或引发免疫反应降低治疗效果。传统三质粒（Helper、RepCap、Payload）共转染法虽广泛应用，但其效率受限的深层机制尚不明确。近年研究提出“时序错位假说”（Temporal Misalignment Hypothesis, TMA），认为衣壳组装早于基因组复制峰值，导致两者脱节，是填充效率低下的关键原因。为验证这一假说并探索优化策略，Chen等人发表于《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》的研究，创新性地通过时序分布转染策略，系统解析了AAV2和AAV2/8的组装动力学差异。

研究采用瞬时转染HEK293F细胞，在细胞接种后24小时（T1）和44小时（T2）分步递送三质粒（Helper、RepCap、Payload），设计7种转染时序方案（A-G），以单次转染（Bmk）为基准对比。关键实验技术包括：qPCR定量病毒基因组（vg/mL）以评估包装效率，ELISA和新型A-CUE（ELISA-free）方法检测完整衣壳浓度，流式细胞术测定转导单位（TU/mL）以评估感染活性，透射电镜（TEM）观察病毒颗粒形态。

结果分析

病毒基因组产量与转染时序的关系

通过qPCR检测nuclease保护的病毒基因组发现，AAV2和AAV2/8对时序调整响应迥异。AAV2/8在多种时序下均保持较高vg/mL产量，而AAV2仅时序F（T1: Helper+Payload, T2: RepCap）和G（T1: Helper+Payload+半量RepCap, T2: 半量RepCap）产量接近Bmk水平。时序F显著提升两种血清型的衣壳填充效率，印证了延迟RepCap引入可改善基因组复制与衣壳组装的同步性。

转导单位产量揭示感染活性差异

流式细胞术显示，AAV2的TU/mL产量普遍高于AAV2/8，但时序A、B、D、E均使AAV2感染活性降至检测限以下，表明衣壳虽能保护基因组，却未必形成感染性构象。AAV2/8的TU/mL与vg/mL趋势一致，凸显其组装稳健性。

衣壳产量与填充效率的精准评估

ELISA检测显示，仅AAV2的Bmk、F、G时序产生可测完整衣壳。时序F使衣壳填充率（vg/衣壳比）提升7.5倍，且A-CUE方法结果与ELISA高度吻合。AAV2/8的A-CUE数据进一步证实时序F的填充优势，但部分时序（如B）衣壳产量反超Bmk，提示血清型间组装调度存在本质差异。

透射电镜验证病毒颗粒形态

TEM图像表明，时序F产生的AAV2和AAV2/8颗粒形态与Bmk无异，排除了时序调整导致结构异常的可能性。

结论与意义

本研究首次通过时序分布转染实验证实TMA假说，揭示AAV2/8比AAV2更耐受时序扰动，强调血清型特异性优化必要性。时序F通过先递送Helper+Payload“预激活”细胞，延迟RepCap引入，有效对齐基因组复制与衣壳组装峰值，为基因治疗生产工艺提供具应用潜力的优化策略。尽管时序F会降低总病毒产量，但其填充效率的提升为下游纯化与疗效优化带来利好。未来结合分子动力学模拟与多组学分析，有望进一步揭示AAV组装调控机制，推动基因治疗载体生产迈向精准化。