METTL3通过m6A修饰circ_0001239/YTHDC2/KLF10轴加重肺炎链球菌诱导的新生鼠肺损伤

《Infection and Immunity》：METTL3 aggravates lung injury in neonatal mice with Streptococcus pneumoniae-induced pneumonia via the circ_0001239/KLF10 axis

本文揭示了METTL3介导的m6A甲基化通过circ_0001239/YTHDC2/KLF10轴加重肺炎链球菌（Spn）诱导的新生鼠肺损伤的新机制，为靶向m6A修饰治疗重症肺炎提供了潜在的治疗靶点。

　　

METTL3在Spn诱导的新生鼠肺炎肺损伤中上调并与肺损伤相关

为了探究甲基转移酶样蛋白3（METTL3）在肺炎链球菌（Spn）诱导的新生鼠肺炎肺损伤中的作用，研究团队首先建立了Spn诱导的新生鼠肺炎模型。与假手术组相比，Spn感染组的新生鼠存活率显著降低，肺组织损伤加剧，支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细菌载量显著升高。此外，Spn感染还显著增加了肺组织的湿干重比和髓过氧化物酶（MPO）活性。在炎症和氧化应激指标方面，Spn处理显著提高了肺组织中白细胞介素（IL）-1β、IL-6和丙二醛（MDA）的水平，同时降低了超氧化物歧化酶（SOD）的活性。通过实时定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）检测发现，METTL3在Spn组新生鼠肺组织中的表达显著上调。随后，通过尾静脉注射携带METTL3短发夹RNA（shRNA）的慢病毒下调METTL3的表达后，新生鼠的存活率得到改善，肺组织损伤减轻，BALF中的细菌载量下降。同时，肺组织的湿干重比和MPO活性降低，IL-1β、IL-6和MDA水平下降，而SOD活性升高。这些结果表明，METTL3的上调与Spn诱导的新生鼠肺炎肺损伤密切相关。

METTL3通过m6A修饰上调circ_0001239的表达

生物信息学数据库预测显示，环状RNA_0001239（circ_0001239）存在m6A修饰位点，且已有研究表明circ_0001239在肺损伤中表达升高。为了验证METTL3对circ_0001239的调控作用，研究人员首先检测了肺组织中的总体m6A水平，发现Spn感染组m6A水平显著高于假手术组，而METTL3敲低后（Spn + sh-METTL3组）m6A水平则显著降低。RT-qPCR结果显示，circ_0001239在Spn感染的新生鼠肺组织中表达上调，而在METTL3低表达的肺组织中其表达被抑制。为了在细胞水平验证这一机制，研究使用了小鼠肺上皮细胞（MLE-12），并转染了sh-METTL3。结果显示，METTL3敲低后，细胞内的总体m6A水平下降。进一步的甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）实验证实，METTL3敲低减少了circ_0001239上的m6A富集。同时，细胞中circ_0001239的表达也随着METTL3的下调而降低。这些发现表明，METTL3通过m6A修饰正向调控circ_0001239的表达。

过表达circ_0001239可减弱METTL3敲低对Spn诱导的新生鼠肺炎的保护作用

接下来，研究团队通过在新生鼠肺组织中过表达circ_0001239，探究其功能。慢病毒注射成功上调了肺组织中circ_0001239的表达。结果显示，在METTL3敲低的背景下，过表达circ_0001239导致新生鼠存活率下降，肺组织损伤加重，BALF中细菌载量增加。此外，肺组织的湿干重比和MPO活性升高，IL-1β、IL-6和MDA水平上升，而SOD活性下降。这些数据表明，circ_0001239的过表达能够逆转METTL3敲低对Spn感染新生鼠肺炎的保护作用，提示circ_0001239是METTL3下游的关键效应分子。

circ_0001239与RNA结合蛋白YTHDC2的相互作用导致KLF10下调

环状RNA可通过与RNA结合蛋白相互作用来调控下游基因表达。通过Starbase数据库预测，YTH结构域包含蛋白2（YTHDC2）是可能与circ_0001239结合的RNA结合蛋白，且预测结合得分最高。进一步预测发现，YTHDC2可能与Krüppel样因子10（KLF10）结合。实验数据显示，在Spn感染的肺组织中，KLF10的表达下调；METTL3敲低后，KLF10表达回升；而在circ_0001239过表达后，KLF10的表达再次受到抑制。在细胞模型中，RNA免疫共沉淀（RIP）实验证实，与IgG对照相比，YTHDC2能够富集在circ_0001239上，同时YTHDC2也能富集在KLF10上。METTL3敲低提升了KLF10的表达，而circ_0001239过表达则抑制了KLF10的表达。此外，circ_0001239过表达降低了KLF10 mRNA的稳定性，而YTHDC2敲低则增强了KLF10 mRNA的稳定性，并相应地改变了细胞中KLF10的蛋白水平。综上所述，circ_0001239通过与YTHDC2相互作用，进而下调KLF10的表达。

敲低KLF10可减弱METTL3敲低对Spn诱导的新生鼠肺炎的保护作用

为了最终验证KLF10在该通路中的关键作用，研究团队通过慢病毒注射敲低了新生鼠肺组织中的KLF10表达。KLF10敲低导致新生鼠存活率降低，肺损伤程度加剧。同时，IL-6、IL-1β和MDA水平升高，SOD活性受到抑制。这些结果证明，KLF10的下调削弱了METTL3敲低对Spn诱导的新生鼠肺炎的保护效应。

讨论

本研究系统阐明了METTL3在Spn诱导的新生鼠肺炎肺损伤中的关键作用及其分子机制。研究发现METTL3通过m6A修饰上调circ_0001239的表达，进而促进circ_0001239与YTHDC2的结合，最终通过降低KLF10 mRNA的稳定性来抑制KLF10的表达，从而加剧肺损伤。该研究不仅揭示了m6A修饰、环状RNA与转录因子在肺炎肺损伤中的新型调控轴，也为开发针对METTL3/circ_0001239/KLF10通路的治疗策略提供了重要的实验依据和潜在靶点。未来的研究可进一步探索该通路的上游调控机制以及KLF10的下游信号网络，以期更全面地理解肺炎肺损伤的病理过程并为临床干预提供新思路。