钙离子和磷酸盐调控的蛋白PcrP介导铜绿假单胞菌对多粘菌素B的耐药性增强机制 中文标题

《Journal of Bacteriology》：The PA2803-encoded PcrP exhibits a novel non-catalytic function and contributes to polymyxin B resistance in P. aeruginosa

本综述系统阐述了铜绿假单胞菌（Pa）在钙离子（Ca2+）和磷酸盐（Pi）双重调控下通过新型蛋白PcrP（PA2803）介导多粘菌素B（PMB）耐药性的分子机制。研究揭示了PcrP作为HAD超家族非催化成员，通过结合Acp3调控KatA活性缓解氧化应激，并参与多聚磷酸盐（polyP）代谢和毒力因子表达，为临床耐药防控提供了新靶点。

　　

钙离子增强铜绿假单胞菌对多粘菌素B的耐药性

研究通过E-test法测定发现，在添加5 mM Ca²⁺的条件下，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, Pa）野生型菌株PAO1对多粘菌素B（Polymyxin B, PMB）的最小抑菌浓度（MIC）显著提高12倍。这一现象与临床环境中囊性纤维化（CF）患者气道内高钙离子浓度（如唾液中的4.8 ± 0.7 mM）密切相关，提示钙离子可能是Pa在宿主环境中适应并增强抗生素耐药性的关键因素。

已知PMB耐药机制不参与钙依赖性耐药

通过转录组分析和突变体验证，研究发现此前报道的PMB耐药相关基因（如双组分系统phoPQ、pmrAB、parRS，外排泵mexAB-oprM，以及脂质A修饰相关arn操纵子等）在钙离子存在时均未显著上调或功能增强。其中phoP、pmrB、parR等基因的突变体在5 mM Ca²⁺条件下并未改变PMB敏感性，表明钙离子诱导的耐药性独立于这些经典通路。

新型基因PA2803、PA3237和PA5317的鉴定

通过化学诱变和功能互补筛选，研究鉴定出三个新型基因（PA2803、PA3237和PA5317）在钙离子依赖的PMB耐药中发挥关键作用。其中PA2803（命名为pcrP）在5 mM Ca²⁺条件下转录水平上调7倍，且其缺失突变体（ΔpcrP）的PMB耐药性显著降低，通过基因回补可恢复表型。序列分析显示PcrP属于HAD超家族（Haloacid Dehalogenase Superfamily），但其功能尚未明确。

PcrP受磷酸盐和钙离子双重调控

PcrP的表达受磷酸盐饥饿和钙离子双重诱导。在低磷酸盐（50 μM）条件下，PcrP转录水平通过PhoB调控上调8.8倍；同时在5 mM Ca²⁺条件下进一步增加。这种双重调控模式提示PcrP可能在宿主感染微环境（如低磷酸盐和高钙离子）中协调Pa的适应性反应。

PcrP缺乏催化活性但形成稳定二聚体

体外酶活实验表明，重组PcrP对底物磷酸乙醛（phosphonoacetaldehyde）和对硝基苯磷酸酯（pNPP）均无水解活性，与其推定的磷酸酶功能不符。通过交联实验和分子动力学模拟，发现PcrP可形成稳定的同源二聚体，但其催化关键残基（如Motif 1中的Asp和Thr、Cap结构域中的Lys等）在进化中丢失，提示其功能可能从催化转向蛋白互作。

PcrP与Acp3和PA3518发生特异性互作

通过免疫共沉淀和细菌双杂交（BTH）实验，研究发现PcrP与酰基载体蛋白Acp3（PA3334）和假设蛋白PA3518发生直接相互作用。这种互作在5 mM Ca²⁺条件下显著增强。分子动力学模拟进一步揭示PcrP与Acp3的结合界面与Acp3-KatA（过氧化氢酶）的结合区域重叠，提示PcrP可能通过竞争性结合Acp3解除其对KatA的抑制。

PcrP调控氧化应激和polyP积累

ΔpcrP突变体在5 mM Ca²⁺条件下细胞内活性氧（ROS）水平显著升高，而野生型菌株的ROS水平降低77%。这表明PcrP通过调控Acp3-KatA通路缓解氧化应激。此外，突变体在多磷酸盐（polyP）积累方面下降48%，说明PcrP参与磷酸盐存储代谢，可能在营养胁迫下提供生存优势。

PcrP影响毒力因子生产和宿主适应

在低磷酸盐条件下，ΔpcrP突变体的绿脓菌素（pyocyanin）产量轻微下降，而绿脓菌素（pyoverdine）合成显著减少77%。同时，膜脂分析显示突变体中鸟氨酸脂（ornithine lipid）含量异常增加，表明PcrP参与脂质代谢重编程。这些变化共同影响Pa在宿主环境中的毒力和适应性。

PcrP同源蛋白的功能演化分析

系统发育分析表明，PcrP与来自Pseudomonas syringae的PSPTO_2114等蛋白构成HAD超家族中的一个独立分支（PA2803亚家族）。这些蛋白均保留二聚化能力但丧失催化活性，提示该亚家族可能普遍演化为蛋白互作模块，通过调控伴侣蛋白功能参与环境适应。

临床意义与未来方向

本研究首次揭示钙离子和磷酸盐通过PcrP介导的非经典通路增强Pa的PMB耐药性。PcrP作为连接离子信号、氧化应激、代谢调节和毒力表达的枢纽蛋白，为针对多药耐药Pa的抗菌策略提供了新靶点。未来需进一步解析PcrP-互作蛋白的复合物结构，并探索其在临床分离株中的表达与耐药性关联。