植物病原菌诱导条件下细菌蛋白质组重塑的分子农业应用评估

《Microbiology Resource Announcements》：Assessment of bacterial proteome remodeling under virulence-inducing conditions for molecular pharming applications

本研究通过质谱蛋白质组学技术，系统分析了根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）在化学诱导剂乙酰丁香酮（acetosyringone）和生物诱导剂本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片提取物作用下的蛋白质组动态变化，揭示了植物叶片提取物可作为低成本替代方案诱导病原菌毒力，为分子农业（molecular pharming）中生物制剂的高效生产提供了新策略。

　　

摘要

研究采用基于质谱的蛋白质组学方法，鉴定了根癌农杆菌在化学诱导剂（乙酰丁香酮）和生物诱导剂（本氏烟草叶片提取物）暴露后丰度显著增加的毒力相关蛋白。结果表明，叶片提取物可作为乙酰丁香酮的成本效益替代方案，用于分子农业行业中病原菌毒力的诱导。

引言

分子农业是利用植物细菌病原体（根癌农杆菌）与宿主（本氏烟草）之间的自然感染过程生产生物制剂（如抗体、疫苗）的技术。与细胞生产系统相比，该技术具有可扩展性增强、安全性提高、生产成本降低以及分子修饰准确等优势。在感染过程中，根癌农杆菌通过IV型分泌系统（T4SS）将其肿瘤诱导（Ti）质粒中的转移DNA（T-DNA）递送至植物细胞，以生产特定目标蛋白。本研究通过定量蛋白质组学分析了已知影响感染性的化学和生物条件下细菌蛋白质组的变化。

材料与方法

本氏烟草叶片经灭菌（70%乙醇30秒、无菌 Milli-Q 水10秒、0.6%活性漂白剂10分钟、两次无菌水洗涤）后冻存于-80°C。根癌农杆菌（菌株 At564A，含曲妥珠单抗载体 pFC0058）在含卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（25 μg/mL）的 LB 培养基中于28°C、200 rpm 振荡培养过夜，并标准化至 OD_600nm 0.2。细菌毒力在室温黑暗条件下诱导24小时，诱导条件包括：100 μM 乙酰丁香酮（农杆菌浸润培养基中）、40 mg/mL 植物叶片匀浆、或40 mg/mL 分段植物叶片与农杆菌浸润培养基预孵育48小时后的上清液（称为叶片提取物）。未诱导对照组仅含农杆菌浸润培养基。

细胞沉淀经4,696×g 离心10分钟收集，用 PBS 洗涤两次后，重悬于含蛋白酶抑制剂混合物的100 mM Tris-HCl（pH 8.5）中，通过探针超声（冰浴，30%振幅，30秒开/30秒关，3循环）在2% SDS 中裂解。加入二硫苏糖醇（DTT，终浓度10 mM）后，样品于95°C、800 rpm 孵育10分钟，冷却后加入碘乙酰胺（IAA，终浓度55 mM），室温黑暗孵育20分钟。蛋白质经丙酮（终体积80%）于-20°C 沉淀过夜，16,100×g 离心后，用80%丙酮洗涤两次，空气干燥，重悬于8 M 尿素/40 mM HEPES 中，并通过色氨酸释放法定量。样品（25 μg）与胰蛋白酶/LysC（蛋白:酶 50:1 w/w）于37°C 消化过夜，并通过 STAGE-tips 纯化。干燥肽段通过 OD_205nm 定量，3 μg 肽段重悬于0.1%三氟乙酸中，经液相色谱（RSLC EasyNano）和电喷雾电离（75 μm × 50 cm PepMap C18 柱）耦合 Orbitrap Exploris 240 质谱仪进行分析，采用数据依赖采集模式（MS1 扫描 top10 肽段，MS2 扫描肽段序列，m/z 范围400–1,600，分辨率60,000）。化学条件（乙酰丁香酮）作为阳性对照采用180分钟梯度分析；生物条件（叶片提取物和匀浆叶片）为优化仪器时间采用90分钟梯度分析。

质谱数据使用 MaxQuant（v. 2.1.0.0）和 Perseus（v. 2.0.7.0）软件分析。搜索数据库为根癌农杆菌参考序列（2019年12月16日；5,344个蛋白）并补充曲妥珠单抗重链、轻链、两个 P19 序列和新霉素磷酸转移酶 II。MaxQuant 设置默认参数，包括无标记定量（最小比率计数2）、最小肽段数2，并启用运行间匹配。在 Perseus 中，过滤修饰位点（如翻译后修饰）、潜在污染物和反向肽段，保留每组四个重复中三个存在的蛋白。NaN 值从正态分布（宽度0.3，下移1.8）插补，“多数蛋白 ID”通过 UniprotKB 数据库注释。火山图通过 Student t 检验（P < 0.05，Benjamini-Hochberg 错误发现率=0.05，S₀=1）评估蛋白丰度显著变化。

结果

主成分分析显示对照组与化学（乙酰丁香酮）或生物（叶片提取物和匀浆叶片）处理样本间存在明显分离。化学处理仅鉴定出3个显著差异蛋白，而叶片提取物与对照组比较有76个显著差异蛋白，匀浆叶片与对照组比较有174个显著差异蛋白。重要的是，毒力相关细菌蛋白（如 VirH1、VirH2、T4SS）在化学处理（乙酰丁香酮）、生物处理（叶片提取物）以及叶片处理间比较中均显著增加。总体而言，本研究证明了根癌农杆菌在化学和生物处理下的蛋白质组重塑，但对毒力因子产生调控的见解有限。

讨论

研究结果表明，植物叶片提取物可有效诱导根癌农杆菌毒力相关蛋白的表达，其效果甚至优于传统化学诱导剂乙酰丁香酮。这一发现为分子农业提供了更经济、更接近自然感染过程的诱导策略，有望优化生物制剂的生产效率。然而，研究对毒力因子调控的具体机制尚未深入揭示，未来需进一步探索蛋白质组重塑背后的分子通路。

数据可用性

基于质谱的蛋白质组学数据可通过 PRIDE Proteome Exchange 获取，登录号为 PXD047349。

致谢

作者感谢 Samanta Pladwig（MSc）在蛋白质组学样品制备中的技术支持，以及 Jason A. McAlister 博士在生物信息学方面的支持。感谢 Bioinformatics Solutions Inc. 在质谱样本检测中的协助。研究资金由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）-合作研究与开发基金（CRDPJ 539389-19）提供给 J.G.-M.，以及安大略研究生奖学金提供给 N.P.。