益生菌启发的杂化纳米囊泡通过调控肿瘤免疫微环境增强免疫检查点疗法效率

《Bioactive Materials》：Probiotic-inspired hybrid nanovesicles for enhancing immune checkpoint therapy efficiency via tumor immune microenvironment modulation

本研究针对免疫“冷”肿瘤对免疫检查点疗法(ICT)响应不佳的难题，创新性地构建了由大肠杆菌外膜囊泡(OMV)与巨噬细胞膜载体(RV)融合的杂化纳米囊泡(ROMV)，并封装细菌代谢物氧化三甲胺(TMAO)，形成ROMV/TMAO仿生系统。该系统模拟肠道益生菌的免疫调节功能，通过协同OMV的免疫激活特性和TMAO诱导M1极化能力，结合RV的肿瘤靶向性，在多种肿瘤模型中有效促进M1型肿瘤相关巨噬细胞极化和CD8+T细胞浸润，显著抑制肿瘤生长。与α-PD-L1联用时展现协同增效作用，为克服微生物疗法安全性限制、增强ICT疗效提供了创新策略。

　　

免疫检查点疗法(Immune Checkpoint Therapy, ICT)虽然 revolutionized 了恶性肿瘤治疗格局，但在胰腺癌等“冷”肿瘤中依然面临响应率低的困境。这类肿瘤的特征是免疫细胞浸润不足和免疫抑制性微环境，使得免疫疗法难以发挥作用。近年来，肠道微生物疗法显示出通过重塑免疫微环境将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤的潜力，但活菌移植存在细菌易位、感染风险和安全担忧等临床应用限制。

为了突破这些瓶颈，研究人员受益生菌免疫调节特性的启发，开发了一种非活性替代策略。他们巧妙地将大肠杆菌分泌的外膜囊泡(Outer Membrane Vesicle, OMV)——保留免疫激活性病原体相关分子模式(PAMPs)但无增殖风险——与具有肿瘤归巢能力的巨噬细胞膜载体(RV)融合，构建了杂化纳米囊泡(ROMV)。进一步封装肠道菌群代谢物氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide, TMAO)，最终形成ROMV/TMAO仿生治疗系统。

研究团队综合运用了膜融合技术构建杂化纳米载体，通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UHPLC-MS/MS)分析药物负载，采用动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)表征纳米颗粒理化性质，并利用共聚焦显微镜观察细胞摄取和溶酶体逃逸。在体内实验中，通过小动物活体成像系统评估靶向能力，借助单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析免疫微环境重塑机制，结合多色流式细胞术和免疫组化验证免疫细胞浸润表型。研究还建立了4T1乳腺癌、Kras^LSL-G12D/+肺癌和KPC胰腺癌三种小鼠模型，并利用来自肺癌患者的手术样本构建了人源肺癌类器官(LCOs)模型进行临床前评价。

2.1. ROMV/TMAO的制备与表征

研究人员成功将RV与OMV融合形成ROMV，并通过SDS-PAGE蛋白谱和共聚焦显微镜验证了融合效果。ROMV/TMAO的水合粒径为83.6±1.7 nm，多分散指数(PDI)为0.274±0.013，zeta电位为-9.21±0.47 mV，电镜显示完整的囊泡结构。TMAO的封装效率和负载能力分别为33.8±3.0%和98.3±0.2%。体外实验表明ROMV/TMAO能被4T1细胞有效内吞，并在6小时后实现溶酶体逃逸。

2.2. 生物分布、安全性及抑瘤效果

小动物成像显示ROMV/TMAO在4T1乳腺癌和Kras^LSL-G12D/+肺癌模型中具有显著肿瘤靶向能力，半衰期约11.6小时。安全性评价表明ROMV/TMAO避免了OMV引起的全身炎症反应（降低IL-6、TNF-α水平），且不诱发TMAO相关的动脉粥样硬化风险。在4T1模型中，ROMV/TMAO治疗组肿瘤重量最低(0.41±0.08 g)，显著诱导肿瘤细胞凋亡。

2.3. 肿瘤免疫微环境调控机制

单细胞测序揭示ROMV/TMAO处理后肿瘤内T细胞比例增加，破骨细胞减少。进一步分析显示CD8⁺T细胞和M1样巨噬细胞增多，而CD4⁺Treg细胞和M2样巨噬细胞减少。差异基因分析发现免疫刺激基因（Ccl5、H2-DMa、H2-Eb1）、CD8标志基因（Cd8a、Cd8b1）和细胞毒性分子（Ifng、Gzmb、Prf1）上调，免疫抑制基因（S100a9、S100a4、Socs3、Cxcr2）下调。GO和KEGG富集分析显示基因显著富集于抗原处理提呈、T细胞受体信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。流式和免疫组化证实ROMV/TMAO促进CD8⁺T细胞浸润和Granzyme B产生，降低Foxp3⁺Treg比例，提高M1/M2比值。细胞耗竭实验证明CD8⁺T细胞和巨噬细胞是ROMV/TMAO抑瘤效果的关键介质，中和IFN-γ或抑制GzmB活性会削弱治疗效果。

2.4. 联合免疫检查点抑制剂的增效作用

在4T1、Kras^LSL-G12D/+和KPC三种模型中，ROMV/TMAO与α-PD-L1联用均显示最强抑瘤效果，显著延长生存期。联合治疗组肿瘤内CD8⁺T细胞浸润和GzmB⁺细胞进一步增加，Foxp3⁺细胞减少，肿瘤细胞增殖指标Ki67下降。

2.5. 在人肺癌类器官中的验证

利用肺癌患者样本构建的LCOs保持了原发肿瘤的组织结构和标志物表达（腺癌：CK7、Napsin A、TTF1；鳞癌：CK5、P63）。ROMV/TMAO处理促进CD8⁺T细胞浸润，与PBMCs共培养时诱导显著肿瘤细胞死亡，并提升IFN-γ和GzmB水平，联合α-PD-L1时效果最佳。

该研究通过仿生设计巧妙整合了OMV的免疫激活特性和TMAO的代谢调节功能，借助RV的靶向递送优势，成功构建了安全高效的ROMV/TMAO纳米系统。该系统有效克服了活菌疗法的安全性局限，通过协同激活TLR和I型干扰素通路，双重调控巨噬细胞M1极化和CD8⁺T细胞功能，从根本上重塑免疫抑制性微环境。在多种临床前模型和人源类器官中的验证表明，ROMV/TMAO不仅单药有效，更能显著增强免疫检查点抑制剂疗效，为转化“冷”肿瘤提供了创新解决方案。这种益生菌启发式的纳米治疗策略为开发下一代免疫治疗佐剂开辟了新方向，具有重要的临床转化前景。研究成果发表于《Bioactive Materials》，为改善实体瘤免疫治疗响应提供了理论依据和技术平台。