基于EvolvR介导突变和稀有密码子选择的谷氨酸棒杆菌γ-谷氨酰激酶原位定向进化提升L-脯氨酸产量

《Biochemical Engineering Journal》：In situ directed evolution of γ-glutamyl kinase in Corynebacterium glutamicum S9114 by innovative EvolvR-mediated mutagenesis and rare codon-based selection to increase L-proline production

本文推荐一种创新性定向进化策略：通过将enCas9-PolI5M融合蛋白整合至谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）基因组，结合稀有密码子选择系统，实现对γ-谷氨酰激酶（GK）编码基因proB的原位定向进化。最终获得三重突变体GKE74K/G149K/V150M，使工程菌株L-脯氨酸产量达94.2±5.6 g/L，为工业菌株构建提供新范式。

　　

亮点

菌株、培养基和培养条件

本研究所用菌株列于补充数据1。出发菌株谷氨酸棒杆菌S9114是中国工业级L-谷氨酸高产菌（实验室保藏）。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌分别于LB培养基和LBG培养基（LB补充5 g/L葡萄糖）中培养。谷氨酸棒杆菌感受态制备和重组子再生参考van der Rest等方法。

摇瓶分批培养...

基于EvolvR系统的谷氨酸棒杆菌创新定向进化策略开发

Halperin等报道的EvolvR系统可通过双质粒（pEvolvR携带nCas9/enCas9与易错DNA聚合酶I的融合蛋白及sgRNA，pTarget携带靶基因）在可调窗口内持续多样化靶基因。该系统已证实在大肠杆菌中能高效多样化用户定义的基因组位点。

结论

本研究重点优化并利用EvolvR介导的突变和稀有密码子选择系统，对L-谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌S9114中GK编码基因proB进行原位定向进化以提升L-脯氨酸产量。首先开发了适用于谷氨酸棒杆菌的EvolvR系统，将enCas9-PolI5M融合蛋白整合至基因组，该系统在谷氨酸棒杆菌中功能正常且显示更高效率。