理性两轮修饰开发含异肽键抗菌肽：增强稳定性及抗多重耐药革兰氏阴性菌活性

本研究通过理性两轮修饰策略对CPF-7抗菌肽进行优化：首轮引入异肽键调控α螺旋结构降低溶血性，第二轮基于酶切位点分析进行氨基酸替换显著提升血清稳定性。最终获得先导肽IP2-D4，其对多重耐药铜绿假单胞菌/鲍曼不动杆菌展现强效抗菌活性（MIC=4–8 μg/mL）、低溶血毒性（MHC20=256 μg/mL）和高稳定性（t1/2=2.932 h），并证实可通过膜破坏机制清除持留菌与生物被膜，在体内感染模型中疗效显著。

　　

亮点

• 通过异肽键修饰理性调控CPF-7的α螺旋构象

• 筛选出高治疗指数（TI）且具膜破坏活性的先导肽

• IP2-D4对多重耐药菌株展现强效抗菌活性（MIC=4–8 μg/mL）

引言

抗生素的发现是20世纪重大医学突破，但耐药性危机日益严峻。多重耐药（MDR）革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌）对传统抗生素耐药性高出10-1000倍，且能通过质粒等可移动遗传元件快速传播耐药基因。抗菌肽（AMPs）因具有独特的膜破坏机制而备受关注，但天然AMPs存在活性不足、毒性高、易被蛋白酶降解等局限。本研究通过两轮化学修饰优化CPF-7肽：首轮利用异肽键调整空间构象，第二轮通过氨基酸替换提升稳定性，最终获得兼具强效抗菌、低溶血和高稳定性的先导肽IP2-D4。

材料与方法

实验采用Fmoc-Rink-MBHA树脂固相合成肽链，使用Boc保护型赖氨酸（Boc-L-Lys(Fmoc)–OH/Boc-D-Lys(Fmoc)–OH）构建异肽键。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析酶切位点，并采用天然/非天然氨基酸替换及肽链环化策略保护易降解位点。

结果

1. 1.
   首轮修饰成功获得系列单点/多点异肽键嵌入肽，其中D构型异肽键显著增强蛋白酶抗性；
2. 2.
   IP2-D4对MDR菌株最低抑菌浓度（MIC）达4–8 μg/mL，溶血毒性显著降低（MHC₂₀=256 μg/mL）；
3. 3.
   该肽可有效清除生物被膜与持留菌，且不易诱导耐药性；
4. 4.
   小鼠皮肤伤口感染与导管相关生物被膜感染模型证实其强效体内抗菌活性；
5. 5.
   RNA测序显示IP2-D4可上调细菌膜相关基因表达，验证其膜破坏机制。

讨论

异肽键修饰通过共价交联精准调控肽链二级结构，在维持抗菌活性的同时降低α螺旋相关性溶血毒性。第二轮修饰成功解决首轮优化肽的血清稳定性缺陷，凸显了理性设计在平衡AMP"活性-毒性-稳定性"三角关系中的价值。IP2-D4为应对MDR革兰氏阴性菌感染提供了具有临床转化潜力的候选分子。