淋巴结内共定位递送免疫治疗药物增强T细胞活化与抗肿瘤反应

《Biomaterials》：Co-Localization of Lymph Node Therapeutics Enhances T Cell Activation and Anti-Tumor Response

本研究针对传统疫苗递送方式在淋巴结靶向性不足的问题，开展了基于可降解微粒的淋巴结内免疫治疗研究。结果表明，抗原与佐剂在同一淋巴结内共定位（无论共封装或混合递送）可激发强大的抗原特异性T细胞反应和抗肿瘤免疫，而空间分离则削弱疗效。该策略为简化免疫疗法化学与生产控制（CMC）流程提供了新思路，具有重要转化意义。

　　

在免疫治疗领域，淋巴结（Lymph Nodes, LNs）作为协调免疫应答的关键枢纽，其重要性日益凸显。传统疫苗注射方式（如肌肉或皮下注射）存在明显局限：仅有少量药物能到达淋巴结，大部分在注射部位代谢或扩散至全身，导致靶向效率低且可能产生脱靶效应。虽然直接淋巴结内注射（i.LN.）能提高局部药物浓度，但如何优化递送策略——例如，是将多种治疗信号（如抗原和佐剂）封装在同一微粒中，还是分别装载后混合——才能更有效激活免疫细胞，并最终诱导强大的抗肿瘤免疫？这个问题对于推动癌症疫苗等免疫疗法的临床转化至关重要。

为了回答上述问题，由Ruochen Shen、Senta M. Kapnick、Camilla Edwards、Ryan A. McIlvaine、Christopher J. Bridgeman、Sean T. Carey和Christopher M. Jewell组成的研究团队在《Biomaterials》上发表了他们的研究成果。他们利用可降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微粒（Microparticles, MPs）作为载体，将模型抗原卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）和Toll样受体激动剂（PolyIC）作为免疫信号分子，系统探究了不同装载策略（共封装于同一微粒[(P+O)MP] vs. 分别封装后混合[PMP+OMP]）以及不同淋巴结空间分布对免疫应答的影响。

研究团队主要采用了以下关键技术方法：通过双乳液溶剂蒸发法制备PLGA微粒；利用骨髓来源的树突状细胞（Bone Marrow-derived Dendritic Cells, BMDCs）进行体外摄取和与OT-I/OT-II转基因小鼠来源的抗原特异性T细胞（CD8⁺ 和 CD4⁺ T cells）的共培养实验；在小鼠模型中进行精确的淋巴结内注射（i.LN. injection）；通过流式细胞术分析细胞表型、增殖和细胞因子产生；使用B16-OVA黑色素瘤模型评估抗肿瘤效果；并通过过继性T细胞转移实验追踪抗原特异性T细胞的体内动态。

Co-encapsulation of immune cues is more efficient in delivering multiple cargos

研究人员首先合成了三种微粒：(P+O)MP（共封装PolyIC和OVA）、PMP（只含PolyIC）和OMP（只含OVA），并将PMP与OMP混合得到PMP+OMP组。体外实验表明，虽然树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）对单个抗原的摄取效率在不同配方间无差异，但(P+O)MP能更高效地将两种货物共同递送至同一细胞，其双阳性细胞比例显著高于PMP+OMP组。这表明共封装策略在细胞水平的共递送效率更高。

Co-encapsulation is more effective in inducing CD8⁺ T cell proliferation in vitro

在BMDC与OVA特异性CD8⁺ T细胞（OT-I来源）的共培养体系中，(P+O)MP和PMP+OMP均能有效激活T细胞（表现为CD44⁺CD62L^-和CD25⁺比例升高）。然而，在诱导T细胞增殖方面，(P+O)MP展现出更强的能力，其增殖细胞比例显著高于PMP+OMP组。这提示共封装可能更有利于通过MHC I类分子途径（主要呈递内源性抗原）激活CD8⁺ T细胞。

(P+O)MP and PMP+OMP expand CD4⁺ T cell proliferation and induce IFN-γ production in vitro

对于CD4⁺ T细胞（OT-II来源），两种配方（(P+O)MP和PMP+OMP）在诱导增殖和干扰素-γ（IFN-γ）产生方面效果相当，均显著优于空白微粒对照组。这表明对于CD4⁺ T细胞的激活，两种递送策略效果相似。

Intra-lymph node delivery of (P+O)MP and PMP+OMP promote anti-tumor immunity

在B16-OVA黑色素瘤小鼠模型中，关键的发现出现了。单次淋巴结内注射(P+O)MP或PMP+OMP均能显著抑制肿瘤生长，并显著延长小鼠生存期，且两者效果无统计学差异。相当比例的小鼠（(P+O)MP: 37.5%; PMP+OMP: 62.5%）获得长期无瘤生存。在存活小鼠中进行的肿瘤再攻击实验中，这些小鼠也表现出良好的免疫记忆保护作用。而将佐剂（PMP）与可溶性抗原（SolO）共同注射，或仅注射佐剂（PMP only），则几乎不产生保护效果，证明抗原的微粒封装对于激发有效的抗肿瘤免疫至关重要。

i.LN. delivery of (P+O)MP and PMP+OMP recruit and expand antigen-specific T cells in LNs

通过过继性转移抗原特异性T细胞（Thy1.2⁺），研究人员发现，在注射了(P+O)MP或PMP+OMP的淋巴结内，招募和扩增的抗原特异性CD8⁺和CD4⁺ T细胞数量显著增加，且绝大多数发生了增殖。两种配方在此方面的效果再次表现出相似性，说明只要抗原和佐剂共存于同一淋巴结微环境，就能有效激活局部T细胞应答。

Location lymph node antigen delivery dictates T cell maintenance and expansion in LNs

接下来，研究团队探索了空间分离的影响。他们将PMP和OMP分别注射到小鼠两侧不同的腹股沟淋巴结（"Split LN"模型）。结果发现，抗原（OMP）所在的淋巴结招募和滞留的抗原特异性T细胞（CD8⁺和CD4⁺）数量远高于佐剂（PMP）所在的淋巴结。尽管在佐剂淋巴结中也检测到少量增殖的CD8⁺ T细胞（可能源于细胞迁移），但CD4⁺ T细胞的增殖反应很弱。这明确表明，抗原的存在是T细胞在淋巴结内驻留和扩增的主要驱动力。

Relative localization of MP cargo dictates anti-tumor immunity

最后，在肿瘤模型中验证空间分布的重要性。与将PMP和OMP共同注射于同一淋巴结（PMP+OMP）产生强大保护作用形成鲜明对比的是，将两者分别注射于不同淋巴结（无论抗原所在淋巴结是否后来成为肿瘤引流淋巴结[tdLN]）的"Split LN"组，其抗肿瘤效果显著减弱，与阴性对照组无显著差异。这强有力地证明，抗原和佐剂在同一淋巴结内的物理共定位是产生有效抗肿瘤免疫的必要条件。

综上所述，本研究得出核心结论：对于淋巴结靶向的免疫治疗，产生强大T细胞反应和抗肿瘤保护效应的关键决定因素是抗原（OVA）和佐剂（PolyIC）在同一淋巴结微环境内的共定位。而实现共定位的载体策略——是共封装于单一微粒中，还是分别封装后混合注射——对最终的免疫效果影响不大。这一发现具有重要的转化医学意义：它意味着在开发淋巴结靶向免疫疗法时，可以采用将不同治疗成分分别装载于各自微粒，然后在使用前简单混合的策略。这种"鸡尾酒"式混合配方能极大简化化学、制造与控制（Chemistry, Manufacturing, and Controls, CMC）流程，避免为每个候选疗法单独优化复杂的共同包封工艺，从而加速个性化癌症疫苗等组合免疫疗法的临床开发和产业化。本研究为设计更灵活、更易于转化的淋巴节点靶向免疫治疗平台提供了坚实的实验依据和新的思路。