IFCC胰腺α-淀粉酶催化活性浓度37°C主要参考测量程序的建立与验证

《Clínica e Investigación en Arteriosclerosis》：IFCC primary reference procedure for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37?°C. Part 10: Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of pancreatic α-amylase

本文推荐IFCC工作组发布的胰腺α-淀粉酶(PAMY)在37°C下的主要参考测量程序(PRMP)。该研究解决了胰腺炎诊断中特异性生物标志物缺乏计量学溯源性的问题，通过单克隆抗体抑制唾液淀粉酶(SAMY)并测量残留活性，实现了PAMY催化浓度向SI单位的直接溯源。四家参考实验室的比对验证显示结果差异仅±1-6%，测量不确定度U=3.5%(k=2)，为临床实验室结果等效性提供了关键技术支撑。

　　

在临床诊断领域，胰腺疾病的精准诊断一直面临挑战。虽然总α-淀粉酶(TAMY)的检测已实现标准化，但其包含唾液和胰腺两种同工酶，缺乏组织特异性。胰腺α-淀粉酶(PAMY)作为更特异的生物标志物，在急性胰腺炎的诊断和监测中具有重要价值，然而长期以来缺乏国际统一的参考测量方法，导致不同实验室结果难以比较，影响临床决策的准确性。

针对这一关键问题，国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)工作组在《Clínica e Investigación en Arteriosclerosis》发表了系列研究的最新成果——胰腺α-淀粉酶在37°C下的主要参考测量程序(PRMP)。该研究基于IFCC总α-淀粉酶参考测量程序，创新性地引入特异性单克隆抗体(TU66和TU88)抑制唾液淀粉酶活性，通过精密的分光光度法测量残留的胰腺淀粉酶催化活性浓度。

研究采用多中心验证设计，四个参考实验室使用统一的核心试剂独立进行方法验证。关键技术方法包括：基于EPS(4,6-ethylidene(G1)-4-nitrophenyl(G7)-α-(1→4)-D-maltoheptaoside)底物的酶动力学检测、单克隆抗体抑制优化、抑制系数(f_p和f_s)测定、以及严格的计量学质量控制。研究样本来源于汉诺威医学院的剩余血清库(伦理批准号3591-2017)和外部质控样品。

2. 材料、方法和程序

研究详细描述了反应原理：胰腺α-淀粉酶催化EPS水解，随后α-葡萄糖苷酶将产物进一步分解为4-硝基苯酚，在405nm波长下监测吸光度变化。试剂准备强调使用最高纯度化学品，特别是胰腺α-淀粉酶不得被唾液α-淀粉酶污染。

3. 测量条件

测量在37.0±0.1°C进行，波长405±1nm，光径10.00±0.01mm。最终反应混合物中包含50mmol/L HEPES缓冲液、特异性单克隆抗体( TU66 4.5mg/L、TU88 64.0mg/L)和5mmol/L EPS底物。

4. 测量设计

研究采用多步骤测量策略：首先通过预实验确定抑制系数f_s(唾液淀粉酶)和f_p(胰腺淀粉酶)，然后分别测量样本在抗体存在(IAMY)和不存在(TAMY)条件下的催化活性。胰腺α-淀粉酶活性通过公式P=(I-f_s·T)/(f_p-f_s)计算得出。

5. 计算

催化浓度计算基于摩尔吸光系数(ε₄₀₅=1012m²·mol^-1)，使用换算因子F=3063将吸光度变化率转化为μkat/L。方法学验证显示检测限(LOD)为2.1U/L，定量限(LLOQ)为6.0U/L。

四家参考实验室的比对研究显示优异的一致性：两个人类血清池(S1、S2)和两个冻干质控样品(E1、E2)的测量结果相对重现性标准偏差为1.0%-5.0%。抑制系数f_p在0.986-1.007之间，f_s在0.025-0.045之间，回收率接近100%(99.9%-100.7%)。

初步参考区间研究基于100名健康成人(≥18岁)队列，确定胰腺α-淀粉酶的参考范围为0.137-0.860μkat/L(8-52U/L)，与罗氏Cobas8000常规方法结果高度一致。干扰试验证实常用镇痛药物如丁丙诺啡和吗啡不干扰测定结果。

6. 讨论

本研究首次建立了胰腺α-淀粉酶的完整参考测量体系，填补了胰腺特异性酶学检测计量学溯源性的空白。虽然方法复杂度高于总α-淀粉酶检测，但3.5%的测量不确定度满足JCTLM对高级参考方法的要求。与常规方法结果的高度一致性证明了其临床适用性。

2015年胰腺α-淀粉酶被纳入RELA外部质量评估体系，为参考实验室提供了持续的质量保证。该方法使临床样本结果的计量学溯源成为可能，为胰腺疾病的精准诊断奠定了基础。

7. 结论

作为IFCC酶学参考程序系列的第10部分，胰腺α-淀粉酶参考测量程序的建立标志着酶学标准化工作的重要进展。该方法不仅为体外诊断行业提供校准服务，还支持二级参考物质的认证，最终实现患者样本结果的可比性和可靠性。

该研究的成功实施得益于国际多中心合作，作者来自德国、意大利、荷兰等国的知名机构，包括汉诺威医学院、米兰大学等，确保了方法的普遍适用性和技术严谨性。随着这一参考系统的推广应用，预计将显著提升全球胰腺疾病诊断的标准化水平。