马来丝虫来源microRNA在猫宿主免疫调节中的作用及靶点预测研究

《Current Research in Parasitology & Vector-Borne Diseases》：Brugia malayi miRNAs and potential targets within the feline host ( Felis catus)

本研究针对丝虫宿主特异性机制尚不明确的科学问题，通过分析感染马来丝虫（Brugia malayi）的猫血浆，开展了寄生虫源性miRNAs的鉴定及其宿主靶基因预测的研究。研究人员利用小RNA测序技术检测到185个潜在的寄生虫miRNA候选物，并通过生物信息学分析预测了Ptgs1、Irf4、Irf5、Stat3等7个免疫相关宿主基因可能是其作用靶点，通路富集分析提示其可能通过调控mTOR、AGE-RAGE等信号通路参与宿主免疫调节。该研究为阐明丝虫免疫逃避机制提供了新的分子视角，并为开发针对寄生虫免疫干预的新策略提供了潜在靶点。

　　

在自然界中，寄生虫与宿主之间存在着精妙而复杂的共进化关系。丝虫这类寄生性线虫，如引起人类淋巴丝虫病（LF）的马来丝虫（Brugia malayi）和班氏丝虫（Wuchereria bancrofti），展现出极高的宿主特异性，通常只能在特定的宿主（如灵长类）体内完成其复杂的生活史。这种特异性是寄生虫得以生存和繁衍的关键，但其背后的分子机制，尤其是寄生虫如何操纵宿主免疫系统以营造有利于自身生存的微环境，仍然是寄生虫学领域亟待深入探索的核心问题。随着研究的深入，科学家们发现，寄生虫分泌的细胞外囊泡（EVs），尤其是其携带的小分子非编码RNA——microRNA（miRNA），可能作为“分子信使”在宿主-寄生虫对话中扮演着关键角色。这些寄生虫源性的miRNA可以进入宿主细胞，通过靶向特定的信使RNA（mRNA），在转录后水平调控宿主基因的表达，从而可能帮助寄生虫实现免疫逃避和长期寄生。然而，在非天然宿主模型中，例如猫感染马来丝虫，这种相互作用的分子图谱尚不清晰。

为了揭示马来丝虫在非天然宿主（猫）中可能存在的miRNA介导的免疫调节机制，由Erica Burkman和Lucienne Tritten等人组成的研究团队开展了一项探索性研究。他们的研究成果以题为“Brugia malayi miRNAs and potential targets within the feline host (Felis catus)”的论文发表在《Current Research in Parasitology》期刊上。这项研究利用了一个独特的实验模型——由于美国境内已无此类猫模型可用，使得本研究成为评估这一特殊宿主-寄生虫相互作用的宝贵机会。

研究人员为开展此项研究，主要应用了几项关键技术。首先，他们通过实验感染短毛家猫（Felis catus），并在一段时间后采集感染动物的血浆样本。其次，利用商业化的试剂盒从血浆中提取总RNA（包括小RNA）。接着，核心步骤是委托专业公司（LC Sciences）进行Illumina高通量小RNA测序，以全面鉴定血浆中的小RNA种类。最后，研究团队进行了深入的生物信息学分析：利用自有的分析流程（ACGT101-miR）将测序获得的 reads 分别比对到猫基因组和马来丝虫基因组等数据库，以区分宿主和寄生虫来源的序列；对鉴定出的寄生虫miRNA候选物，使用TargetScan和miRanda两种算法预测其在猫基因组中的潜在靶基因；并对预测到的靶基因集合进行了KEGG通路富集分析，以揭示其可能影响的生物学过程。

3.1. 从感染马来丝虫的猫体内鉴定出的MicroRNAs

研究人员从4只出现微丝蚴血症的猫血浆样本中成功提取了总RNA，并进行了小RNA测序。通过对约3200万条可比对序列的分析，他们共鉴定出185个独特的、可能来源于线虫（主要是马来丝虫）的miRNA序列，其中包括43个已知miRNA和142个预测的候选miRNA。根据序列比对质量和二级结构预测的可信度，这些miRNA被分为不同的组别（Group 1-4），其中Group 1a和1b（直接比对到miRBase中已知的线虫miRNA前体并能在基因组上定位）以及Group 2a和2b（虽未直接比对到已知前体但能在基因组上定位并可能形成发夹结构）的miRNA可信度最高。在所有这些候选miRNA中，有26个miRNA在测序中出现了10个或更多拷贝，被认为是高丰度表达的。值得注意的是，有12个miRNA属于高可信度组别，它们主要属于MIR-10、MIR-71、MIR-34等miRNA家族。丰度最高的miRNA包括bma-miR-100的三种亚型（d, a, c）、bma-let-7以及多个属于MIR-36家族的miRNA（如来自其他线虫的同源物）。此外，还发现了一个新的候选miRNA（PC-3p-18742_26），它仅能比对到马来丝虫基因组，可能是一个马来丝虫特有的新型miRNA。

3.2. 与其他宿主中丝虫miRNA的比较

为了评估丝虫miRNA在不同宿主系统中的保守性，研究人员将本研究在猫血浆中发现的马来丝虫miRNA与已报道的其他丝虫（如犬恶丝虫 Dirofilaria immitis 感染狗、罗阿丝虫 Loa loa 感染狒狒、旋盘尾丝虫 Onchocerca volvulus 感染人、奥氏丝虫 Onchocerca ochengi 感染牛）在其各自宿主血液中检测到的miRNA进行了比较。综合分析五个数据集共451个miRNA候选物，发现仅有47个miRNA家族存在重叠，且没有发现任何一个miRNA是所有五种丝虫所共有的。重叠数量最多的是马来丝虫和犬恶丝虫之间。这种有限的保守性可能源于多种因素，包括不同研究采用的检测技术灵敏度差异、宿主血容量不同导致的miRNA稀释效应（大型宿主如牛、狒狒的血液可能更稀释），以及丝虫miRNA表达可能存在虫种特异性、发育阶段特异性和性别特异性。

3.3. 猫基因组中的预测靶点

研究的关键步骤是预测已鉴定的高丰度马来丝虫miRNA（26个）以及高可信度miRNA（12个）在猫基因组中的潜在靶基因。研究人员分别使用了TargetScan和miRanda两种广泛应用的靶基因预测软件进行分析，并设定了严格的筛选标准（如TargetScan的加权上下文++得分 ≤ -1.0）。两种软件预测到了大量潜在的靶基因相互作用，但它们的预测结果重叠度较低，显示出算法间的差异。通过整合两种算法的结果并应用严格过滤，研究人员最终聚焦于那些被共同预测且具有较高置信度的靶点。通路富集分析（使用Enrichr软件和KEGG 2019_Mouse数据库）显示，这些预测的靶基因显著富集于多条信号通路。使用TargetScan预测时，有107条通路显著富集，而miRanda预测出40条显著通路，其中有32条通路是两种方法共同预测到的。这些共同富集的通路包括MAPK信号通路、mTOR信号通路、ErbB信号通路以及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等，提示这些通路可能是马来丝虫miRNA干预宿主细胞功能的重要节点。

特别值得关注的是，研究人员从预测结果中筛选出七个与免疫系统功能密切相关的宿主基因，认为它们可能是马来丝虫miRNA的关键潜在靶点。这些基因包括：Ptgs1（前列腺素G/H合酶1，即COX-1）、Irf4（干扰素调节因子4）、Irf5（干扰素调节因子5）、Numbl（Numb样蛋白）、Tnfsf15（肿瘤坏死因子配体超家族成员15）、Stat3（信号转导与转录激活因子3）以及Txlnb（β-Taxilin）。每个基因都可能被一个或多个特定的马来丝虫miRNA所靶向。例如，bma-let-7预测靶向Ptgs1，bma-miR-228和lin-4预测靶向Irf4，bma-miR-34预测靶向Numbl，bma-miR-92和lin-4预测靶向Tnfsf15，lin-4预测靶向Stat3，而bma-let-7和cbn-mir-35f预测靶向Txlnb。这些基因分别参与炎症反应（Ptgs1）、天然免疫和干扰素应答（Irf5）、淋巴细胞活化和抗体产生（Irf4）、细胞命运决定（Numbl）、血管生成和T细胞调节（Tnfsf15）、细胞因子信号转导和免疫细胞分化（Stat3）以及细胞内囊泡运输（Txlnb）等多种关键生物学过程。

4.1. 与其他宿主中miRNA的比较

本研究鉴定出的丝虫miRNA与其他宿主中发现的同源物存在有限的重叠，这反映了丝虫miRNA表达的复杂性。这种差异可能并非完全源于生物学差异，技术因素（如测序深度、宿主背景信号）和生物学因素（如宿主血容量、寄生虫发育阶段和性别）都可能影响检测结果。尽管如此，将本研究发现的miRNA与其它寄生虫、啮齿类模型和体外研究中的同源物进行比较，有助于推测其潜在功能，并支持其在当前数据集中的鉴定可靠性。

4.2. 猫基因组中的免疫调节靶点

对预测靶点的深入分析揭示了马来丝虫miRNA可能干预宿主免疫系统的多种潜在机制。所筛选出的七个关键免疫相关基因功能各异：Ptgs1（COX-1）是前列腺素合成的关键酶，其失调可能影响炎症反应；Irf5是I型干扰素诱导的核心转录因子，影响天然免疫应答；Irf4对淋巴细胞（特别是B细胞和T细胞）的活化、分化及抗体产生至关重要；Stat3参与Jak-STAT信号通路，广泛调控免疫细胞功能；Numbl涉及细胞命运决定，可能影响免疫细胞功能；Tnfsf15（VEGI）可抑制血管生成并调节T细胞免疫；Txlnb的功能虽不甚明确，但可能参与细胞内运输。这些基因的调控，尤其是抑制性调控，可能有助于寄生虫削弱宿主的抗寄生虫免疫反应，例如通过抑制炎症（靶向Ptgs1）、削弱干扰素应答（靶向Irf5）、阻碍抗体产生（靶向Irf4）或改变免疫细胞分化（靶向Stat3）等方式，从而为寄生虫建立和维持感染创造有利条件。已有体外实验证据表明，某些线虫来源的miRNA可以下调IRF-4和mTOR等关键转录因子。通路富集分析进一步支持了这种多靶点、多通路的干预模式，特别是mTOR信号通路和AGE-RAGE信号通路在寄生虫感染免疫调节中的潜在作用已受到关注。AGE-RAGE信号通路的激活可促进促炎状态和Th1细胞分化，而mTOR通路是细胞代谢、生长和免疫的关键调节器。寄生虫miRNA对这些通路的干预可能共同导向抑制宿主有效免疫、促进免疫耐受或病理改变的方向。

4.3. 模型局限性

本研究也存在一些局限性。高通量测序（NGS）是发现新miRNA的有力工具，但其定量准确性相对较低，本研究侧重于表达模式的整体分析而非单个miRNA的精确定量，因此未进行qPCR验证，这在全局miRNA谱分析研究中是常见做法。在靶点预测方面，依赖于生物信息学工具，其中TargetScan是持续更新和维护的可靠工具，而miRanda则较为陈旧，导致两种工具预测结果重叠度不高，这降低了预测结果的确定性。此外，免疫相关基因仅占预测靶点的一小部分（约1%），表明马来丝虫miRNA可能对宿主具有更广泛的影响。未来研究若能结合感染性第三期幼虫（L₃）等不同发育阶段的样本，有望揭示阶段特异性的miRNA表达谱，从而更全面地理解丝虫的感染建立和维持机制。

本研究成功地从感染马来丝虫的猫血浆中鉴定出大量寄生虫来源的miRNA候选分子，并预测了其在猫宿主中的潜在靶基因，特别是七个与免疫应答相关的关键基因。生物信息学分析提示，这些miRNA可能通过干预mTOR、AGE-RAGE等多个信号通路，参与对宿主免疫系统的精细调控，这为解释丝虫如何在非天然宿主中实现免疫调节和长期寄生提供了新的分子线索。尽管预测结果需要后续实验验证，且研究模型存在一定局限，但这项工作极大地丰富了我们对丝虫-宿主相互作用分子机制的认识，所筛选出的关键靶点和通路为未来开发干扰寄生虫免疫逃避、控制丝虫病的新型治疗策略提供了有价值的理论依据和潜在靶点。