营养条件调控的多菌种生物膜形成及其对消毒剂耐受性的协同效应研究

《Food Microbiology》：Conditional synergy: Impact of nutrient abundance on multispecies biofilm formation and sanitizer tolerance

本研究针对食品工业中多菌种生物膜对消毒剂耐受性增强的难题，探讨了营养丰度对荧光假单胞菌(P. fluorescens)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)和单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)单菌及多菌种生物膜形成及次氯酸钠耐受性的影响。研究发现高营养条件(TSB)下多菌种生物膜呈现协同作用，生物量(O.D590)、胞外多糖含量(μg/cm2)和消毒剂耐受性显著高于低营养条件(10% TSB)，其中单核细胞增生李斯特菌在多菌种生物膜中存活量(5.3 log CFU/cm2)较单菌生物膜(2.3 log CFU/cm2)显著提升。该研究为食品工业中针对不同营养环境制定精准消毒策略提供了理论依据。

　　

在食品加工厂的生产线上，看似洁净的不锈钢表面可能潜藏着肉眼无法察觉的微生物堡垒——生物膜。这些由多种细菌聚集形成的结构化群落，如同微生物的"城市"，能够抵抗常规消毒剂的猛烈攻击。尤其令人担忧的是，当食源性病原菌如单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)与环境中常见的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)共同形成多菌种生物膜时，其耐受性会显著增强。据统计，因生物膜清除不彻底导致的交叉污染已占全球食品安全事件总数的25%。更复杂的是，食品工业表面经过频繁清洗后往往处于营养匮乏状态，而营养条件如何影响多菌种生物膜的形成及其消毒剂抗性，至今仍是食品微生物安全领域的知识盲区。

为解决这一关键问题，梅西大学食品技术与自然科学学院的Krisha Pant等人在《Food Microbiology》上发表研究，通过系统分析不同营养条件下三种常见食品相关细菌的单菌及多菌种生物膜特性，揭示了营养依赖的协同效应机制。

研究人员采用晶体紫染色法测定生物膜生物量(O.D₅₉₀)，通过平板计数法量化生物膜细胞浓度(log CFU/cm²)，利用酚-硫酸法测定胞外多糖(EPS)含量，并评估了次氯酸钠(50 ppm/5 min)处理后的细菌存活量。通过共聚焦显微镜观察生物膜空间结构，并采用统计学方法分析各参数间的相关性。所有实验均使用从该校食品微生物实验室保藏库获取的菌株，在聚苯乙烯表面进行标准化培养。

3.1 生物膜形成

研究发现营养丰度显著影响生物膜形成能力。在完整强度TSB中，所有菌株的单菌及多菌种生物膜生物量均显著高于10% TSB条件(p < 0.001)。值得注意的是，多菌种生物膜的相互作用模式完全取决于营养条件：在TSB中，除荧光假单胞菌与单核细胞增生李斯特菌组合呈中性相互作用外，其余多菌种组合均表现为协同作用；而在10% TSB中，大多数组合呈现拮抗作用。这表明细菌间的协同关系需要充足的营养支持才能实现。

3.2 生物膜形成：细胞浓度

尽管生物量存在显著差异，两种营养条件下的生物膜细胞浓度却无统计学差异(p > 0.05)。在三种菌混合生物膜中，营养条件改变了优势菌群结构：10% TSB中金黄色葡萄球菌(7.7 log CFU/cm²)占主导地位，而TSB中三种菌浓度趋于平衡(7.7-8.3 log CFU/cm²)。这一发现说明营养环境能够调控多菌种生物膜的种群结构。

3.3 胞外多糖含量

完整强度TSB培养的生物膜EPS产量显著高于10% TSB条件(p < 0.001)。特别值得注意的是，三菌种生物膜在TSB中的EPS产量(60.9 μg/cm²)达到单菌生物膜的2-5倍，且与晶体紫染色结果高度一致，证实EPS是多菌种协同效应的关键物质基础。

3.4 消毒剂耐受性

低营养条件下形成的所有生物膜经消毒剂处理后均低于检测限(<2.1 log CFU/cm²)，而高营养条件下的多菌种生物膜表现出显著耐受性。单核细胞增生李斯特菌的耐受性提升最为明显，在双菌种生物膜中的存活量较单菌生物膜提高3倍以上。三菌种生物膜中所有菌株均表现出协同保护效应，验证了多菌种合作的生存优势。

3.5 生物膜形成与消毒剂抗性的相关性

Pearson相关性分析揭示EPS浓度与消毒剂耐受性呈显著正相关(0.618)，而细胞浓度与耐受性无显著关联(0.146)。这一关键发现说明生物膜的物理化学屏障(EPS)而非细胞数量，是决定消毒剂抗性的主要因素。

3.6 营养条件引起的结构变异

共聚焦显微镜观察显示，营养匮乏条件下生物膜形成隆起状突起结构，而营养充足时则形成致密分层。这种结构差异与EPS产量和消毒剂耐受性直接相关，证实了营养条件通过影响生物膜三维结构来调控其功能特性。

本研究通过多角度实验证实，营养条件是多菌种生物膜协同作用与消毒剂耐受性的关键决定因素。高营养环境不仅促进EPS大量产生，还诱导形成致密生物膜结构，为嵌入其中的细菌提供物理保护。特别值得注意的是，单核细胞增生李斯特菌作为弱势菌种，在多菌种生物膜中获得的保护效应最为显著，这解释了为何在工业环境中该病原菌能够通过与其他菌群合作而持续存在。

研究成果对食品安全生产具有重要指导意义：通过控制食品加工表面的营养残留水平，可能成为抑制多菌种生物膜形成、增强消毒剂效果的有效策略。这种基于微生物生态学原理的干预手段，比单纯提高消毒剂浓度更具可持续性和针对性，为开发新一代食品安全控制技术提供了理论基础。未来研究需要进一步探索动态条件下不同工业材料表面的生物膜行为，以及营养调控影响细菌协同作用的分子机制，从而完善基于微生物群体行为的食品安全控制体系。