家蚕丝腺eccDNAfib-L的复制与转录机制及其在丝蛋白合成调控中的新功能

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Replication and transcription of eccDNAfib-L, an extrachromosomal circular DNA in the silk gland of silkworm, Bombyx mori

本文首次揭示家蚕丝腺中542 bp的染色体外环状DNA（eccDNAfib-L）存在双链与单链两种形态，其复制机制类似线粒体DNA，并能通过滚环转录机制以反义链为模板进行无终止转录。该研究通过实验证实了微DNA（microDNA）的自主复制与转录能力，为eccDNA在基因调控和基因组可塑性中的功能提供了直接证据。

　　

^研究亮点

细胞培养

秋粘虫（Spodoptera frugiperda）Sf9细胞和家蚕（Bombyx mori）BmN细胞使用TC-100培养基（Thermo Fisher Scientific公司）在26°C下培养，培养基中添加了10%胎牛血清（Biological Industries公司）。

eccDNA^fib-L单双链形态验证

为确认eccDNA^fib-L存在单链与双链形态，我们分别用限制性内切酶NcoⅠ（特异性切割双链DNA）和核酸酶S1（特异性消化单链DNA）处理丝腺提取的DNA。双链质粒pMD19T-eccDNA^fib-L经NcoⅠ酶切后，通过Primer1可PCR扩增出133 bp的特异性条带P1（图1B）；而eccDNA^fib-L连接区经相同处理仍能检测到完整环状结构，表明其同时存在单链形态。进一步通过链特异性PCR验证了正链eccDNA^fib-L-ss(+)和负链eccDNA^fib-L-ss(-)的存在。

eccDNA^fib-L的复制能力探究

通过BrdU掺入实验发现，双链与单链eccDNA^fib-L均能在Sf9细胞中进行复制。Southern blot结果显示其复制产物呈典型的θ型结构，提示复制机制可能与线粒体DNA类似，涉及链置换和滚环复制模式。突变实验进一步证实505-506 nt处的GC碱基对为复制起始关键位点。

eccDNA^fib-L的转录特性分析

RT-PCR及Northern blot结果表明，eccDNA^fib-L-ds能通过滚环机制产生超长转录本，且转录以反义链为模板，方向与基因组中fib-L基因一致。通过CRISPR/Cas9介导的GC→TA/TG突变实验，证实505-506 nt为转录起始位点（TSS）。该转录过程依赖RNA聚合酶Ⅱ（RNAP Ⅱ）及多种转录因子协同作用。

讨论

本研究首次从实验层面证实微级eccDNA具备自主复制与转录能力，其滚环转录机制突破了线性DNA的转录终止限制。eccDNA^fib-L通过放大fib-L基因表达信号，可能在家蚕丝蛋白高效合成中扮演"分子增强器"角色。该发现为理解eccDNA在非肿瘤生物过程中的调控功能开辟了新视角。