工程化新型轻链单域抗体(VHHL)实现IgG格式双特异性抗体的模块化设计

《Antibody Therapeutics》：Engineering a novel light-chain single-domain antibody to enable IgG-format bispecific antibody design

本研究针对传统双特异性抗体(bsAb)因结构复杂导致的表达量低、均一性差及疗效不稳定等问题，开发了一种基于轻链工程化的新型抗体平台。研究人员通过理性设计与噬菌体展示筛选，成功构建了具有独立抗原结合能力的轻链单域抗体(VHHL)，并将其重构至全长IgG中，形成结构完整、双靶点功能保留的bsAb。该研究为开发结构稳定、生产效率高的新型双特异性抗体提供了创新性解决方案，对肿瘤及免疫疾病治疗具有重要意义。

　　

在生物制药领域，抗体药物始终占据主导地位，而双特异性抗体(bsAb)因其独特的双靶点机制成为最具潜力的下一代抗体疗法。自2009年首个bsAb药物卡妥索单抗获批以来，已有十多种双特异性抗体上市，在肿瘤、遗传病和自身免疫疾病治疗中展现出卓越潜力。然而，现有bsAb形式仍面临表达量低、均一性差以及因复杂结构导致的疗效不稳定等问题。因此，突破现有技术局限，开发结构更稳定、表达效率更高的新型bsAb形式，成为多靶点协同治疗的新需求。

传统单克隆抗体(mAb)的抗原结合特异性由重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)共同决定，两者结构相互依赖。单独表达任一可变区通常会导致结构稳定性差和易聚集倾向。此前研究中，团队曾开发模块化重组策略，将人源V_H域分为框架元件和多样性元件，通过系统筛选和重构不同重链亚族的框架，获得稳定性与溶解性更优的优化支架，进而生成全人源单域抗体(UdAb)。在此基础上，研究人员进一步提出假设：人源V_L域也可被工程化为功能性抗原结合单域形式。值得注意的是，多项研究表明人源V_L通常比重链V_H更不易聚集，可能更适用于治疗用途。此外，将此类单域V_L重构至常规IgG框架中，并保留其与靶向不同表位的重链组合后的独立抗原结合功能，为生成具有天然IgG结构的bsAb提供了新策略。

然而，目前已鉴定的抗原结合V_L片段大多受限于低结合亲和力（通常在数百纳摩尔至微摩尔水平），这为后续功能验证和治疗开发带来显著挑战。同时，这些V_L分子使用不同人轻链亚族作为支架独立鉴定，导致稳定性、溶解性等理化性质存在较大异质性。因此，系统化开发明确且稳定的V_L支架，并具备强大抗原结合潜力，可为构建IgG格式bsAb提供新颖且通用平台，为多靶点治疗带来新机遇。

本研究通过理性设计与噬菌体展示筛选，生成了一类新型重组轻链单域抗体（命名为VHHL），并鉴定出两个靶向小鼠CD16（mCD16）的候选分子L6和L15，其具备良好结合亲和力和生物物理特性。为探究其稳定性结构基础，团队通过X射线晶体学解析了L6的晶体结构（分辨率3.05?）。进一步，遵循模块化设计原则，将VHHL重新组装至全长IgG中。这种新型重构抗体在保留天然IgG结构完整性的同时，维持了重链和轻链的独立抗原结合活性，从而为bsAb生成提供了一种简化而灵活的方法。

研究中运用的主要关键技术方法包括：采用骆驼免疫与V_HH扩增获取特异性CDR序列；通过互补决定区3（CDR3）移植与CDR1/CDR2定点突变组合策略构建VHHL；利用噬菌体展示库筛选与富集特异性抗体；借助X射线晶体学解析抗体结构；使用模块化组装与替换策略将VHHL重构为IgG格式；并通过生物层干涉术(BLI)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)和流式细胞术等多技术手段全面表征抗体性质。实验所用细胞系包括Expi293（表达细胞）和SKOV-3（人卵巢腺癌细胞），实验动物为羊驼。

Establishment of an engineering strategy for human light chain variable region

本研究首先建立了人轻链可变区工程化策略。由于人κ轻链基因座多态性显著低于重链，团队选择使用频率较高的IGKV3-20 * 01等位基因作为轻链单域抗体支架。为赋予其抗原结合能力，研究人员将骆驼纳米抗体CDR移植至IGKV3-20支架，构建重组轻链单域抗体(VHHL)。通过评估不同CDR移植策略（“移植”和“替换”）对表达的影响，发现仅移植CDR3（T1和T2策略）时VHHL表达效果最佳，且在CDR1和CDR2移植中，“替换”策略比“移植”对轻链支架的结构扰动更小。进一步，团队通过IMGT和AbYsis数据库分析骆驼与人重链CDR1和CDR2的氨基酸频率分布，设计两种不同突变策略，最终建立了结合CDR3移植与CDR1/CDR2定点突变的轻链工程化方法，为后续开发具有抗原结合能力的VHHL奠定基础。

Identification of mCD16-specific VHHLs

为验证上述轻链工程化策略，研究选择mCD16作为靶抗原。通过免疫羊驼并成功诱导出mCD16特异性抗体后，采用两步PCR法扩增重链可变区，再通过逐步组装将各多样性元件与轻链支架拼接，成功获得VHHL片段。构建两个VHHL噬菌体文库并经过四轮淘选后，通过多克隆噬菌体ELISA观察到mCD16特异性结合噬菌体的显著富集。从17个候选分子中，经SDS-PAGE纯度验证和BLI特异性结合评估，最终鉴定出4个mCD16特异性VHHL，其中L6和L15表现出更优的均一性，被选为后续验证分子。

Binding activity of mCD16-specific VHHLs

BLI结合动力学分析显示，L6与mCD16的结合亲和力（K_D值为54.3±1.41 nM）高于L15（126.0±3.39 nM）。值得注意的是，两者均保留与蛋白L的结合能力，而实验室此前鉴定的全人源重链单域抗体n501则无此结合，表明VHHL在引入骆驼CDR后仍维持轻链特性。使用Capto L树脂无需外源标签即可高效纯化，显著简化下游工艺并降低生产成本。

Crystallization and structural determination of light-chain single-domain antibody L6

L6的晶体结构显示其采用典型免疫球蛋白可变域折叠，由7条β链组成β片层核心，3个CDR向外延伸形成抗原结合表面。电子密度图显示所有CDR环均清晰连续，模型精确度高。与天然IGKV3-20框架（PDB:5IBT）叠加后，仅0.853?的RMSD表明CDR移植未引起主干结构显著扰动。与AlphaFold3预测模型比较发现，实验结构中CDR呈共平面钩状构象，可能增强与平坦或沟槽状表位（如mCD16）的结合，而预测模型则呈现更分散的环构象，全局RMSD达1.63?，且78%偏差位于CDR区，凸显出现有预测算法在工程化抗体拓扑建模中的局限性。

Development of a novel IgG-format bsAb platform based on VHHL

为将VHHL成功重构至全长IgG，团队首先分析了PDB中与IGKV3-20自然配对的人重链可变区（IGHV）亚族，发现IGHV1-58、IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-53和IGHV5-51配对频率较高。为避免Fc介导的与mCD16交叉反应，选择与mCD16结合较弱的人IgG4（hIgG4）作为Fc类型。将抗人HER2（hHER2）纳米抗体11A4人源化后与VHHL（L6或L15）组合，构建出模块化组装的bsAb。SEC-HPLC显示所有hIgG4格式bsAb均一性良好，保留时间与对照抗体nivolumab（Opdivo）一致。ELISA和流式细胞术验证了重链对hHER2的结合活性，BLI证实轻链对mCD16的结合能力得以保留。

进一步，研究尝试通过直接替换现有mAb轻链为VHHL的策略快速构建bsAb。选择靶向RABV的17C7和靶向hTNF-α的golimumab（Gmab）为模型，仅替换轻链而保留亲本mAb的原始hIgG1框架。成功表达后，SEC-HPLC显示结构完整性与常规mAb CR3022相当。为消除hIgG1 Fc与mCD16的交叉反应，将bsAb重构为hIgG4格式后，BLI证实轻链（对mCD16）和重链（对原始抗原）的结合特异性均得以保留。

研究结论表明，本研究成功建立了基于VHHL的抗体平台，通过理性抗体工程化生成具有良好生物物理特性的轻链单域抗体。晶体结构解析揭示了CDR移植后的结构耐受性与抗原识别机制，模块化重构策略则使VHHL能融入全长IgG，形成结构完整、双特异性功能保留的新型bsAb。这一平台不仅为抗体药物开发提供了新工具，尤其为肿瘤免疫治疗等领域带来了简化、灵活的bsAb构建方案，显著降低生产成本并提升开发效率。

然而，该平台仍存在一些局限性：针对特定靶抗原生成抗原结合VHHL分子的成本较高，需通过免疫获得，耗时耗力，不利于快速开发针对多样抗原的bsAb；此外，尽管解析了L6的晶体结构，但其与mCD16抗原的精确相互作用界面尚未明确，未来需通过复合物结构解析深入探索轻链单域抗体的分子识别基础。

总之，该研究通过创新性轻链工程化策略，为下一代抗体治疗药物的开发提供了重要技术支撑和理论依据。