非线性孟德尔随机化分析揭示25-羟基维生素D与心血管结局风险的非线性关系

《European Heart Journal》：Non-linear Mendelian randomization analyses on 25-hydroxyvitamin D and the risk of cardiovascular outcomes

本刊推荐：针对维生素D（25(OH)D）与心血管疾病（CVD）风险关联的争议，研究人员采用非线性孟德尔随机化（NLMR）方法进行再分析。结果发现，使用新型双排序NLMR方法后，未发现遗传预测的25(OH)D与血压或CVD风险存在非线性关联（P非线性≥0.40），提示先前基于残差NLMR的结论可能存在偏倚。该研究凸显了MR方法学发展的重要性。

　　

维生素D，特别是其在体内的主要循环形式——25-羟基维生素D（25(OH)D），长期以来被认为与心血管健康密切相关。观察性研究反复提示，低水平的25(OH)D与较高的高血压和心血管疾病（CVD）风险相关联。这引发了广泛的兴趣，即通过补充维生素D来改善心血管结局是否是一种有效的公共卫生策略。然而，观察性研究容易受到混杂因素和反向因果关系的干扰，难以确定其因果关系。为了克服这一局限，孟德尔随机化（MR）这一遗传流行病学方法应运而生。MR利用与暴露因素（如25(OH)D水平）密切相关的基因变异作为工具变量，来推断暴露与结局之间的因果关联，因为基因型在生命早期即已确定，可以有效避免传统观察性研究的某些偏倚。

在此背景下，Zhou等人于2022年在《European Heart Journal》发表了一项研究，他们不仅报告了25(OH)D与血压、CVD风险的观察性关联，还采用了当时先进的非线性孟德尔随机化（NLMR）方法——残差NLMR法进行分析。其初步分析结果似乎支持维生素D缺乏（即非常低的25(OH)D浓度）在CVD风险中起作用，暗示补充维生素D可能对严重缺乏者有益。这项研究引起了学界关注。然而，科学探索是一个不断自我校正的过程。近两年后，Burgess的方法学研究指出，残差NLMR方法在其核心假设——遗传效应在整个暴露分布中恒定不变——被违反时，可能会产生有偏倚的结果。尽管Zhou等人在原研究中使用当时的假设检验方法未发现问题，但后续的模拟研究证实，即使遗传效应在人群中真实存在变异，残差NLMR法也可能使观察到的遗传与暴露关联显得人为地同质。这一方法学缺陷直接波及了Zhou等人的研究结论，正如Davey Smith随后指出的那样，该问题同样影响了其他使用残差NLMR的研究，导致一些论文需要修正。鉴于上述原因，《European Heart Journal》编辑部于2025年将Zhou等人的原论文撤稿。

这一撤稿事件并非故事的终点，而是更深层次科学讨论的起点。编辑部邀请作者使用更新的双排序NLMR方法重新进行分析并再次投稿。然而，作者Elina Hypp?nen和Ang Zhou经过慎重考虑，决定拒绝重新提交。他们在此篇讨论论坛文章中阐述了三大理由。首先，已有最新发表的研究，包括对心血管疾病死亡率的修订分析，使用双排序NLMR方法后，均未能证实25(OH)D具有因果效应。虽然Zhou等人原研究的具体结局指标有所不同，但他们确认，使用双排序法重新分析其数据后，结论是相似的：未发现遗传预测的25(OH)D与血压或CVD风险之间存在非线性关联（所有NLMR分析的P_非线性值均大于等于0.40）。其次，近期的一项模拟研究对双排序NLMR方法本身也提出了质疑，表明其基本假设在存在混杂和基因-环境交互作用时也可能被违反，从而导致结果偏倚。这让人怀疑双排序NLMR在当前研究背景下提供因果遗传证据的能力，并凸显了进一步方法学发展的必要性。第三，从逻辑上推演，即使提升维生素D水平确实仅对浓度极低的人群有益，双排序分析法检测这种关联的统计效能也可能不足。这是因为在使用该方法时，低浓度参与者被分布到暴露分布的不同层级中，即使是最低层级也常常包含了浓度各异的个体，从而稀释了潜在的真实效应。

该讨论论坛文章并未涉及具体的实验操作步骤，其核心在于方法学的比较与再分析。研究主要基于已有的遗传数据汇总统计量进行二次分析。关键的技术方法包括：

1. 1.
   非线性孟德尔随机化（NLMR）分析：核心方法，用于探究暴露（25(OH)D）与结局（血压、CVD风险）之间可能存在的非线性因果关系。最初使用的是残差NLMR法，后应编辑部要求尝试了更新的双排序NLMR法。
2. 2.
   遗传工具变量：使用与25(OH)D水平相关的遗传变异作为工具变量进行MR分析。
3. 3.
   统计假设检验：对NLMR方法的核心假设（如遗传效应恒定性）进行检验，并计算非线性关联的P值（P_非线性）来评估统计显著性。
4. 4.
   参考已有研究数据：作者在论证中引用了其他已发表的采用双排序NLMR法的研究结果（如Sofianopoulou等人的研究和Hypp?nen等人的再分析）来支持其观点。这些研究可能基于大型生物样本库（如英国生物银行）的数据。

研究结果

方法学局限性导致初始结论不可靠

最初使用残差NLMR方法的分析提示，25(OH)D对血压和CVD风险的影响可能仅限于浓度极低的个体。然而，后续方法学研究揭示，残差NLMR法在遗传效应非恒定的情况下会产生偏倚，这使得最初的阳性发现变得不可靠。

采用新方法后未发现显著非线性关联

应编辑部要求，作者使用更新的双排序NLMR方法对数据进行了重新分析。结果显示，遗传预测的25(OH)D与血压或CVD风险之间均无显著的非线性关联（所有NLMR分析的P_非线性≥ 0.40）。这一结果与近期其他使用相同方法研究维生素D与心血管结局的文献结论一致。

新方法本身面临挑战

尽管双排序NLMR法被提出作为残差法的改进，但最新的模拟研究表明，该方法在存在混杂和基因-环境交互作用时，其假设也可能被违反，导致结果存在偏倚的风险。这表明当前可用的NLMR方法仍不完善。

统计效能考量

即使维生素D补充仅对严重缺乏者有效，双排序NLMR法由于其分层方式（将不同浓度的个体混合在同一层级），可能缺乏足够的统计效能来检测这种局限于特定低浓度群体的效应。

研究结论与意义

Hypp?nen和Zhou的讨论文章最终得出结论，当他们使用更新的、但目前同样面临质疑的双排序NLMR方法重新分析数据时，并未发现遗传学证据支持25(OH)D水平与血压或CVD风险之间存在非线性因果关系。这一否定性结果与他们最初基于残差NLMR法得出的、并导致论文撤稿的结论形成了鲜明对比。

此项工作的核心意义远超维生素D与心血管健康关系的具体争议，它深刻地揭示了方法学进步对科学结论可靠性的决定性影响。该案例生动展现了科学研究是一个动态演进、不断自我校正的过程。最初看似可靠的分析，随着方法学认识的深化，可能被证明存在缺陷。更重要的是，它强调了对复杂统计方法保持批判性审视的重要性。即使是最前沿的方法，其 underlying assumptions（基本假设）也可能存在局限，并在特定情境下导致偏倚。NLMR方法（包括残差法和双排序法）在探索非线性因果关系方面是强大的工具，但它们仍在发展之中，需要进一步的方法学研究和验证。

最后，作者明确指出，NLMR方法目前面临的挑战与既定的公共卫生指南（如针对维生素D缺乏的补充建议）是基于不同性质的证据（如随机对照试验或观察性研究），不应直接混淆。MR研究遇到的困难，应被视为推动方法学评估和发展的契机，从而在未来产生更稳健的因果推断证据。这项发表在《European Heart Journal》上的讨论，不仅澄清了一项具体研究的争议，更为整个流行病学和遗传学领域提供了关于方法学严谨性和科学透明性的宝贵一课。