综述：NANOS RNA结合蛋白变异体：理解人类不育症的一个模型

《Journal of Applied Genetics》：The NANOS RNA-binding protein variants: a model for understanding human infertility

这篇综述深入探讨了NANOS RNA结合蛋白变异体在人类不育症中的关键作用。文章系统阐述了NANOS作为高度保守的生殖细胞形态发生素，通过调控mRNA稳定性与定位，在生殖细胞稳态维持中的核心功能。作者提出以NANOS变异体为模型，结合干细胞分化（如W15细胞系）、互作组学（如eCLIP/TMT-MS）等前沿技术，有望揭示不育症的新型分子通路（如CCR4-NOT复合物招募、P-body形成），为开发精准诊疗策略提供新视角。

　　

NANOS RNA结合蛋白变异体：理解人类不育症的一个模型

引言

不育症是全球性的重大健康挑战，影响高达七分之一的夫妇。尽管体外受精等技术取得了突破，但其成功率有限，因此深入探究不育症的分子机制至关重要。许多不育症病因与破坏生殖细胞稳态的遗传变异相关。利用致病性变异构建人类不育症模型，可以增进我们对生殖细胞发育分子通路的理解。NANOS就是一个典型例子，这是一种在物种间高度保守的生殖细胞形态发生素，其变异体从果蝇到人类的各种动物模型中均与不育症相关。

NANOS是高度保守的生殖细胞形态发生素

NANOS是一种被广泛研究的、参与生殖细胞发育的形态发生素，存在于从海绵到人类的多种生物中。在哺乳动物中，NANOS进化出三个旁系同源物：NANOS1、NANOS2和NANOS3。它们具有不同的生殖功能：NANOS2参与雄性生殖细胞发育，而NANOS1和NANOS3在原始生殖细胞（PGC）性别决定之前更早表达，可能对两性生殖细胞发育均很重要。

NANOS是一种转录后调控因子，控制生殖细胞中特定mRNA的水平。它是一种RNA结合蛋白（RBP），具有一个保守的C端RNA结合域，该结构域由两个锌指（2xCCHC）构成，负责与RNA和蛋白质相互作用。其N端区域是非结构化的，在脊椎动物中包含一个称为NOT1相互作用基序（NIM）的短片段，该基序通过直接结合CCR4-NOT转录复合物亚基1（CNOT1）支架蛋白来招募去腺苷酸化复合物，促进mRNA靶标的去腺苷酸化和降解。NANOS最著名的蛋白质伙伴是PUMILIO，后者能识别mRNA 3'非翻译区（3'UTR）中的特定基序。NANOS主要作为PUMILIO的效应因子促进其结合的靶标降解，但也能独立于PUMILIO抑制mRNA靶标，例如小鼠精原细胞中的NANOS2。NANOS2与RNA结合蛋白Dead End Protein Homolog 1（DND1）相互作用并协作，将mRNA靶标装载到去腺苷酸化复合物上，这对小鼠生殖细胞发育至关重要。

NANOS，控制动物界生殖细胞的生殖颗粒组分

生殖颗粒是生殖细胞的关键特征，是其特化和发育所必需的。这些无膜的细胞质凝聚物含有RNA和RNA结合蛋白，形成核糖核蛋白复合体，在雌雄生殖细胞发育的特定阶段发生动态重塑。在低等生物中，生殖颗粒构成更高级的生殖质结构，并由卵母细胞遗传。而在哺乳动物中，生殖细胞并非由遗传的生殖质决定，而是在胚胎发生早期由近端外胚层细胞响应周围胚外组织的信号而特化。人类生殖颗粒首次在PGC进入初级性腺后被鉴定出来。随着人类多能干细胞（如W15细胞系）体外定向分化为PGC模型的发展，研究发现在PGC特化期间，NANOS3以及更近发现的NANOS1开始表达。然而，NANOS1和NANOS3在生殖细胞特化这一早期阶段的具体作用，以及它们是否参与此时生殖颗粒的形成，仍是未解之谜。

生殖颗粒作为生殖细胞发育过程中RNA加工和转录后调控的中心。因此，NANOS作为一种存在于多种生物生殖颗粒中的转录后基因表达调控因子，似乎是其结构的重要组成部分。

NANOS2基因与男性不育

在小鼠中，NANOS2基因在PGC进入初级性腺后立即在雄性生殖细胞发育中发挥关键作用，并参与维持精原细胞、对抗其分化。NANOS2的破坏会导致雄性不育。对波兰队列中214名非梗阻性无精子症或少精子症不育男性患者的研究发现了两个NANOS2杂合变异体：p.H68Q和一个同义单核苷酸替换p.H109H。这两个变异体均位于高度保守的RNA结合域内，且在400名生育力正常的男性中未发现。然而，由于p.H68Q与Y染色体无精子因子（AZF）区域的微缺失共存，且缺乏其他家庭成员的数据，这两个变异体是否导致男性不育尚不明确。

NANOS3基因在男性和女性不育中的作用

在小鼠中，NANOS3的表达始于PGC特化之时，远早于其向性腺脊的迁移。因此，敲除NANOS3基因会导致两性生殖细胞完全缺失。NANOS3从PGC形成早期开始表达，被认为是PGC的标志物，并持续至成年性腺生殖细胞中。已知其能在迁移过程中保护PGC免于凋亡，并对配子发生至关重要。

NANOS3在人类生育力中的重要性已得到充分证实，尤其与女性生殖健康相关。在两名巴西姐妹中鉴定出与原发性卵巢功能不全相关的NANOS3纯合基因变异体p.E120K，该变异体产生了一个稳定的NANOS3蛋白，但位于锌指结构域内的氨基酸替换（E120K）预期会损害其结合mRNA靶标或蛋白伙伴的能力。体外研究表明，携带此变异体的细胞表现出较野生型更低的抗凋亡能力。进一步机制研究发现，NANOS3与PUMILIO2（PUM2）直接结合SIAH1 E3泛素蛋白连接酶1（SIAH1） mRNA的3'UTR并抑制其表达，而p.E120K变异体抑制SIAH1 mRNA的效能显著降低。然而，针对此NANOS3变异体在生殖细胞中全部RNA靶标的系统性筛选尚未报道。对同一波兰不育男性队列的筛查未发现NANOS3的潜在致病性变异。

NANOS1基因在男性不育中的作用

与NANOS2和NANOS3不同，小鼠中的NANOS1似乎对生殖或其他生理过程没有显著作用。但人类NANOS1的情况并非如此。在对非梗阻性无精子症或少精子症不育男性的研究中，发现NANOS1基因的一个杂合变异体等位基因，携带双突变p.[P34T; S78del]。该变异体与支持细胞唯存综合征（睾丸生精小管内生殖细胞完全缺失）相关，且在生育力正常的男性队列中未发现。携带此变异体的女性仍具有生育能力。在模拟人PGC的TCam-2细胞系中进行的验证实验表明，过表达变异体蛋白会诱导细胞凋亡，而野生型NANOS1则发挥抗凋亡作用。RNA测序（RNA-seq）分析发现，野生型NANOS1能下调多个促凋亡基因（如GADD45A、GADD45B、GADD45G、RHOB），而变异体则无此效应。该变异体位于NIM区域，可能影响其招募去腺苷酸化复合物的能力。值得注意的是，p.S78del缺失位于一段小鼠NANOS1中不存在的25个氨基酸的N端区域内，提示这可能是进化过程中出现的功能获得性突变，使得NANOS1对人类生育力变得至关重要。

研究还发现，NANOS1也能与PUMILIO2协同抑制SIAH1 mRNA，但变异体的抑制效果显著减弱。在精子发生过程中，NANOS1定位于染色质体（CB），这是一种哺乳动物精子发生特有的生殖颗粒，作为RNA加工中心。人CB含有NANOS1、PUMILIO2和DEAD-Box Helicase 20（DDX20），这些蛋白彼此相互作用。值得注意的是，NANOS1变异体与DDX20的相互作用显著减弱。这引发了新的问题：该变异体是否会诱导CB的重塑，以及这种重塑是否参与导致不育。NANOS1是目前唯一被鉴定出变异体可导致人类不育的生殖颗粒组分。

基于NANOS模型理解人类不育症的未来展望

利用不育相关NANOS变异体建模人类不育症，仍有许多重要问题有待解答。由于NANOS蛋白与RNA和蛋白质均相互作用，可以采用CLIP或TRIBE等方法系统筛选其RNA靶标，并结合转录组学和蛋白质组学方法研究其辅助蛋白，以鉴定野生型和变异型NANOS1及NANOS3的核糖核蛋白互作组。下一步是确定这些相互作用在携带NANOS不育相关变异体的生殖细胞分化过程中是否被破坏，以及是否产生表型效应。由于伦理限制，难以获取体内早期PGC进行研究，因此利用人多能干细胞（如W15细胞系）体外分化为PGC的模型极具价值。通过基因编辑使多能干细胞系表达突变型NANOS1或NANOS3，再将其分化为PGC，随后分析与患者表型一致的表型效应，将验证该模型的有效性。最终，此类模型可用于识别由变异体引起的不育症背后被破坏的分子通路，为未来开发先进的诊断方法和治疗选择奠定基础。