Vutiglabridin作为PON2调节剂在帕金森病临床前模型中的神经治疗作用研究

《Molecular Neurodegeneration》：Neurotherapeutic effects of Vutiglabridin as a Paraoxonase-2 modulator in preclinical models of Parkinson’s disease

本研究针对帕金森病治疗中氧化应激和线粒体功能障碍等关键病理环节，首次系统评价了新型小分子药物Vutiglabridin通过调节Paraoxonase-2(PON2)发挥神经保护作用的机制。研究人员发现Vutiglabridin能有效穿透血脑屏障，在MPP+诱导和α-syn A53T过表达的PD模型中显著改善线粒体功能、减少ROS生成、保护多巴胺能神经元，且这些效应均依赖于PON2的存在。该研究为开发以PON2为靶点的帕金森病治疗新策略提供了重要实验依据。

　　

在老龄化社会快速发展的今天，帕金森病作为第二大神经退行性疾病，其全球发病率呈现令人担忧的增长趋势。这种疾病最典型的病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的选择性丢失，以及α-突触核蛋白(α-syn)的异常聚集形成路易体。尽管帕金森病的具体发病机制尚未完全阐明，但越来越多的证据表明线粒体功能障碍和氧化应激在其病理进程中扮演着关键角色。特别值得注意的是，多巴胺能神经元由于同时含有 dopamine 和铁离子，对氧化应激尤为敏感——dopamine 能够自动氧化成醌类物质，而铁离子可催化Fenton反应产生大量超氧自由基和过氧化氢。

近年来研究还发现，星形胶质细胞在帕金森病病理过程中发挥着重要作用。位于星形胶质细胞线粒体内的单胺氧化酶B(MAO-B)被抑制后，能显著减少活性氧(ROS)的产生，从而减缓帕金森病的神经退行性进程。此外，研究还发现星形胶质细胞中过度的γ-氨基丁酸(GABA)产生会加剧帕金森病症状，而抑制MAO-B可降低星形胶质细胞GABA水平，这对于改善运动功能障碍、保护黑质中酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元以及减轻星形胶质细胞和小胶质细胞肥大都具有重要意义。

在这项发表于《Molecular Neurodegeneration》的研究中，研究人员将目光投向了对氧磷酶2(PON2)——这是一种具有内酯酶活性的 ubiquitously 表达的细胞内膜蛋白，具有抗氧化特性，能特异性减少线粒体超氧化物的释放。与主要存在于血液中的PON1不同，PON2在脑组织中表达较高，特别是在多巴胺能脑区，且在星形胶质细胞中的表达高于神经元。值得注意的是，PON2的表达水平与年龄和性别相关，这或许可以解释为何帕金森病在男性中的发病率是女性的两倍。

为了探索针对PON2的新型治疗策略，研究人员对一种新开发的小分子药物Vutiglabridin(HSG4112)进行了系统评价。Vutiglabridin是天然异黄烷类化合物glabridin的化学稳定且强效的衍生物，其安全性已通过成功的1期临床试验验证，目前正在进行针对早期帕金森病患者的2a期临床试验。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过定量全身放射自显影(QWBA)和LC-MS/MS分析评估药物脑分布；利用分子对接模拟和细胞热转移实验(CESTA)研究药物-靶点相互作用；在MPP⁺处理的SH-SY5Y细胞模型和MPTP诱导的小鼠帕金森病模型中评估线粒体功能；使用PON2基因敲除(KD)细胞和小鼠模型验证靶点特异性；通过AAV-α-syn A53T病毒注射建立遗传性帕金森病模型；采用免疫组织化学和行为学测试评价神经保护效果。

Vutiglabridin穿透血脑屏障的能力

研究人员首先验证了Vutiglabridin能否有效穿透血脑屏障这一中枢神经系统药物开发的关键瓶颈。化学结构分析显示，Vutiglabridin是一种高疏水性化合物，其辛醇-水分配系数(log D)大于3.69。体外渗透性试验表明，Vutiglabridin不是P-糖蛋白(P-gp)的底物，这为其良好的脑分布特性提供了理论基础。通过¹⁴C标记的Vutiglabridin进行的定量全身放射自显影分析发现，单次口服10 mg/kg后，药物在脑组织中的分布水平达到血浆的2.5倍。在C57BL/6J小鼠中的进一步药代动力学研究证实，单次口服50 mg/kg Vutiglabridin后，脑组织中的药物浓度在6小时达到峰值，为血浆浓度的2.7倍，脑组织AUC_24h为血浆的2.6倍。这些结果一致表明Vutiglabridin能够有效穿透血脑屏障并在脑组织中保持较高浓度。

Vutiglabridin对MPP⁺诱导的线粒体损伤的保护作用

在证实了脑分布特性后，研究人员在细胞水平评估了Vutiglabridin对线粒体功能的保护作用。在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中，1 mM MPP⁺处理24小时可诱导明显的线粒体损伤，而Vutiglabridin处理后能剂量依赖性地逆转这种损伤。具体表现为：恢复NADH脱氢酶复合物1活性、提高细胞内ATP含量、降低DCF-DA检测的细胞总ROS水平和MitoSOX检测的线粒体超氧化物水平。通过Seahorse XF-24分析仪检测氧消耗率(OCR)发现，Vutiglabridin能剂量依赖性地挽救MPP⁺诱导的基础呼吸、ATP转换率和最大呼吸容量下降。同时，Vutiglabridin还能使糖酵解ATP(GlycoATP)和线粒体ATP(mitoATP)的产生速率恢复正常。值得注意的是，低至1 nM的Vutiglabridin就能显著恢复MPP⁺诱导的损伤，这表明该化合物具有极高的效价。

Vutiglabridin与PON2的相互作用

为了阐明Vutiglabridin的作用机制，研究人员重点研究了其与PON2的相互作用。由于PON2的三维结构尚未解析，研究团队通过同源建模的方法，以已知结构的PON1(61.7%序列同一性，79.2%序列相似性)为模板，构建了PON2的三维结构模型。分子对接模拟显示，Vutiglabridin的(R)和(S)两种对映体都能与PON2建立疏水性和非疏水性(极性和静电)相互作用，且结合能力强于其母体化合物glabridin。质谱结合实验进一步证实，Vutiglabridin能与重组人PON2(rePON2)直接结合，解离常数(K_d)为78 nM，表明两者在纳摩尔水平具有较高的亲和力。细胞热转移实验(CESTA)发现，用50 mg/kg和100 mg/kg Vutiglabridin处理小鼠5天后，脑组织中PON2的热稳定性显著提高，熔解温度(T_m)比 vehicle 组提高了约1.3-1.4℃。在6-羟基多巴胺(6-OHDA)处理的原代星形胶质细胞中，Vutiglabridin能剂量依赖性地降低ROS水平，30μM浓度下效果尤为显著，IC₅₀为21μM。

PON2在Vutiglabridin神经保护作用中的必要性

为了确认PON2是否是Vutiglabridin发挥神经保护作用所必需的，研究人员建立了PON2基因敲低(KD)的SH-SY5Y细胞模型。Western blot和实时定量PCR分析证实，慢病毒shPON2感染的PON2-KD细胞中PON2蛋白(两种异构体)和mRNA表达降低了约60%。在对照scrambled shRNA感染的细胞中，Vutiglabridin能显著恢复MPP⁺诱导的线粒体损伤，但在shPON2感染的细胞中，Vutiglabridin对线粒体功能的改善作用被大幅削弱或几乎完全消除。Seahorse分析显示，Vutiglabridin能在对照细胞中恢复MPP⁺诱导的基础呼吸、ATP转换率和最大呼吸容量损伤，但在shPON2细胞中无效。值得注意的是，与对照细胞相比，shPON2细胞对MPP⁺诱导的线粒体损伤更为敏感，表现为细胞和线粒体ROS水平进一步升高，整体OCR曲线完全被抑制。

Vutiglabridin在MPTP注射小鼠中对多巴胺能神经元和运动行为的保护作用

在细胞水平证实了Vutiglabridin依赖于PON2的神经保护作用后，研究人员在MPTP诱导的小鼠帕金森病模型中进行了验证。通过连续5天腹腔注射MPTP(30 mg/kg/天)建立亚急性帕金森病模型，并在MPTP注射前10天开始口服给予不同剂量的Vutiglabridin(0、1、50和100 mg/kg/天)，持续总共21天。以不可逆MAO-B抑制剂rasagiline(0.1 mg/kg)作为阳性对照药。行为学测试显示，MPTP注射显著增加了杆试验中到达地板的时间(T-LA)和旋转棒试验中跌落潜伏期，而Vutiglabridin和rasagiline处理都能显著改善这些运动功能障碍。免疫组织化学染色表明，Vutiglabridin能剂量依赖性地增加黑质致密部(SNpc)中TH阳性细胞数量和纹状体(ST)中TH阳性纤维密度，效果与rasagiline相当。由于50 mg/kg和100 mg/kg Vutiglabridin在神经保护效果上没有明显差异，研究人员确定50 mg/kg为后续体内研究的最大有效剂量。

PON2敲低小鼠中Vutiglabridin神经保护作用的丧失

为了在体内水平确认PON2是否介导Vutiglabridin的神经保护作用，研究人员在PON2敲低(PON2-KD)小鼠中进行了MPTP诱导的亚急性帕金森病模型研究。这些PON2-KD小鼠是通过在PON2第二个内含子中插入基因陷阱载体而产生的。实时定量PCR分析证实，PON2-KD小鼠全脑中PON2 mRNA水平几乎完全消失。研究发现，在野生型小鼠中，50 mg/kg Vutiglabridin处理三周能显著减轻MPTP诱导的运动行为损伤和多巴胺能神经元损伤，但这些神经保护效应在PON2-KD小鼠中完全消失。此外，在非MPTP注射的野生型小鼠中，50 mg/kg Vutiglabridin处理不会引起运动行为或多巴胺能神经元数量和纤维密度的变化，表明Vutiglabridin本身在野生型小鼠中不会诱导任何行为或神经元损伤，其在MPTP模型中的疗效确实是对抗MPTP注射的特异性作用。

p<0.05,p<0.001 vs.Vehicle group(Vuti 0 without MPTP);#p<0.05,###p<0.001 vs.MPTP+Vehicle group(Vuti and Vuti 50) for 21 consecutive days(n=5~8). All groups except'>

Vutiglabridin在AAV-A53T帕金森病模型中减轻α-syn病理和保护多巴胺能神经元

为了验证Vutiglabridin对α-syn病理的影响，研究人员使用了向SNpc注射AAV-α-syn A53T突变体(AAV-A53T)的小鼠模型。与MPTP模型中在MPTP注射前给予Vutiglabridin不同，在AAV-A53T模型中，研究人员在SNpc注射诱导AAV-A53T模型后给予Vutiglabridin，以评估其作为疾病修饰药物的潜力。AAV-A53T双侧注射到SNpc后四周，通过垂直网格试验确认帕金森病运动症状的表现。从第五周开始，给予50 mg/kg Vutiglabridin治疗七周。在此期间，每两周进行一次垂直网格试验以评估效果。结果显示，与vehicle组相比，Vuti组的运动行为逐渐改善，在治疗5-7周后(第10-12周)步态失败指标出现统计学显著性改善。AAV-A53T注射12周后的组织分析显示，与vehicle组相比，Vuti组SNpc中TH阳性细胞数量显著增加，多巴脱羧酶(DDC)阳性细胞也显著增加，表明存在休眠的多巴胺能神经元。Vuti不仅增加了TH阳性和DDC阳性细胞数量，还减轻了TH阴性/DDC阳性的休眠多巴胺能神经元状态，从而重新激活休眠的多巴胺能神经元并改善运动功能。同时，Vuti通过减少反应性星形胶质细胞标志物GFAP来减轻炎症，这种炎症的减轻也导致星形胶质细胞中GABA含量的降低。在α-syn和ROS等毒素的慢性影响下，神经胶质细胞被慢性激活，难以清除α-syn。Vuti有效减轻了星形胶质细胞和小胶质细胞等神经胶质细胞的炎症，使GFAP和Iba1水平正常化。鉴于正常化的神经胶质细胞功能能促进聚集α-syn的有效清除，Vuti给药降低了细胞内α-syn水平。

此外，基于先前研究中建立的PON2活性测定方法，研究人员观察到Vutiglabridin能调节PON2活性。具体而言，在A53T小鼠模型和WT+Vuti组中，Vutiglabridin处理后PON2蛋白水平保持不变，但酯酶和内酯酶活性在A53T病毒暴露后降低，而在Vutiglabridin处理后原代培养的星形胶质细胞中这两种活性均增加。这些发现表明Vutiglabridin直接结合PON2并调节其活性，而不改变其表达水平。

Vutiglabridin的神经毒性评估

Vutiglabridin的整体安全性已通过人体1期临床试验得到证实。但