氧化应激通过Itch介导的TXNIP降解触发NF-κB活化促进慢性阻塞性肺疾病

《Respiratory Research》：Oxidative stress triggers Itch-mediated TXNIP degradation and NF-κB activation promoting chronic obstructive pulmonary disease

本研究针对慢性阻塞性肺疾病(COPD)中持续性炎症的诱导机制不明确这一关键问题，深入探讨了氧化应激通过调控E3泛素连接酶Itch介导的硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)降解，进而激活NF-κB信号通路的分子机制。研究发现香烟烟雾(CS)诱导的氧化应激通过激活MAPK信号通路促进Itch表达，导致TXNIP发生蛋白酶体降解，从而解除对NF-κB的抑制作用，驱动巨噬细胞炎症反应。临床样本分析显示COPD患者肺组织、支气管肺泡灌洗液细胞和外周血单个核细胞中TXNIP表达显著降低而Itch表达升高，揭示了Itch/TXNIP/NF-κB轴在COPD发病机制中的重要作用，为COPD的治疗提供了新的潜在靶点。

　　

慢性阻塞性肺疾病(COPD)作为一种常见的慢性炎症性肺病，其主要特征包括肺部结构改变、小气道狭窄和肺实质破坏。烟草使用和二手烟暴露是COPD最常见的危险因素，其中香烟烟雾(CS)诱导的氧化应激在引起炎症、细胞衰老和DNA损伤方面起着至关重要的作用。尽管巨噬细胞介导的持续性炎症被认为在COPD发病机制中发挥关键作用，但持续性炎症的诱导机制仍不清楚。尤其值得关注的是，氧化应激激活的各种细胞内信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和转录因子核因子κB(NF-κB)，经常与氧化还原敏感的分子靶标相互作用，从而驱动炎症介质的诱导。目前，针对COPD治疗中慢性和持续性炎症的有效分子靶向策略已被广泛考虑，因此，控制持续性炎症的潜在机制需要更深入的研究。

硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)最初被鉴定为1α,25-二羟基维生素D3处理的HL-60细胞中差异表达的基因，也称为维生素D3上调蛋白1。TXNIP的上调与糖尿病、缺血性卒中、心血管疾病和神经退行性疾病等相关，而TXNIP表达的降低通常与肿瘤的发生相关。此外，作为α-抑制蛋白家族的成员，TXNIP在特定的亚细胞区室中可作为支架蛋白发挥作用，增强NLRP3炎症小体的形成，在氧化应激下促进白细胞介素(IL)-1β的产生，并在缺氧期间调节缺氧诱导因子1α(HIF1-α)的核输出和降解。因此，TXNIP的蛋白质稳定性和基因表达可以响应多种刺激而受到调节，随后影响各种生物过程的信号级联反应。

尽管氧化应激和P2X7/炎症小体通路在CS诱导的COPD的发展和恶化中的作用已得到确认，但TXNIP在调节CS相关肺部炎症中的作用及其分子机制仍不清楚。发表在《Respiratory Research》的这项研究通过系统的实验设计，揭示了CS诱导的氧化应激通过Itch介导的TXNIP降解激活NF-κB驱动炎症的新机制，为理解COPD的发病机制提供了重要见解。

研究人员主要运用了细胞模型(小鼠RAW264.7巨噬细胞)、动物模型(全身香烟烟雾暴露12周的小鼠)和临床样本(非COPD患者和COPD患者的肺组织、支气管肺泡灌洗液细胞和外周血单个核细胞)相结合的研究策略。关键技术方法包括：蛋白质免疫印迹分析基因表达、免疫组织化学和免疫荧光染色进行组织定位、短发夹RNA(shRNA)基因沉默技术、NF-κB荧光素酶报告基因检测、活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)检测等。

Cigarette smoke extract initiates TXNIP reduction and iNOS expression

研究发现香烟烟雾提取物(CSE)显著抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞中TXNIP的表达，同时诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)的表达。CSE以剂量依赖方式显著诱导NO产生，并能有效诱导JNK、p38 MAPK和ERK的磷酸化。特别值得注意的是，JNK和p38 MAPK抑制剂SP600125和SB203580的存在分别显著减轻了CSE引起的TXNIP降低，表明MAPK信号通路在调节TXNIP表达中起关键作用。

Decreased TXNIP expression in the lungs of smoking mice

在动物模型层面，经过12周CS暴露后，小鼠肺部出现显著的免疫细胞浸润和异常气腔扩大。吸烟小鼠肺组织中NF-κB p65丝氨酸536位点的磷酸化水平升高，表明CS暴露能有效触发NF-κB调节的炎症反应。更重要的是，与正常小鼠相比，吸烟小鼠肺组织中TXNIP水平显著降低，且在表达CD11b的肺巨噬细胞中TXNIP表达被强烈抑制，表明TXNIP的下调可能与CS刺激诱导的巨噬细胞中NF-κB激活和肺部炎症相关。

Oxidative stress-regulated proteasomal degradation of TXNIP

研究人员进一步探讨了氧化应激在调节TXNIP表达中的作用。通过免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹分析，在吸烟小鼠肺组织中检测到氧化损伤和脂质过氧化的敏感标志物4-羟基壬烯醛(4-HNE)以及氧化应激生物标志物硝基酪氨酸(NitroTyr)的明显升高，表明TXNIP下调与氧化应激之间存在潜在协调关系。外源性H₂O₂处理以剂量依赖方式下调RAW264.7细胞中TXNIP表达，而蛋白酶体抑制剂MG132和lactacystin的存在明显逆转了H₂O₂引起的TXNIP下调，表明氧化应激可能启动TXNIP发生蛋白酶体降解。内源性ROS诱导剂TPA同样诱导RAW264.7细胞中TXNIP降解，而ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)显著减弱TPA诱导的TXNIP降解。MG132、lactacystin和NAC同样减弱了CSE诱导的TXNIP降解，证明香烟吸烟可能诱导氧化应激调节的TXNIP蛋白酶体降解。

ROS mediates MAPK-regulated TXNIP degradation and NF-κB activation

在H₂O₂刺激的RAW264.7细胞中，NF-κB的核转位显著增加，且NF-κB核转位与细胞中TXNIP降解同时发生。H₂O₂处理有效诱导TXNIP降解，这与JNK、p38 MAPK和ERK的磷酸化相关。使用特异性抑制剂SP600125、PD98059和SB203580药理学抑制MAPKs，可抑制H₂O₂诱导的TXNIP降解以及随后的NF-κB激活，表明ROS诱导的NF-κB激活可能受MAPK介导的TXNIP降解调节。

Itch expression modulates TXNIP-mediated NF-κB activation

研究发现E3泛素连接酶Itch在TXNIP降解机制中起关键作用。在吸烟小鼠肺组织中观察到Itch表达的轻微增加，CSE暴露以浓度依赖方式诱导RAW264.7细胞中Itch表达，H_{2O2和TPA刺激RAW264.7细胞中Itch表达，而TPA升高的Itch表达在NAC存在下部分被抑制。在MAPK抑制剂SP600125和SB203580存在下，H2O2刺激的Itch表达部分被抑制。此外，MG132稳定TXNIP，进而减弱H2O2刺激的NF-κB磷酸化，表明TXNIP表达部分影响ROS刺激的NF-κB激活。通过RNA干扰特异性沉默Itch表达后，H2O2诱导的TXNIP降解在Itch敲低的RAW264.7细胞中明显逆转，且H2O2介导的NF-κB激活在Itch敲低细胞中显著减弱，伴随着TXNIP的稳定。因此，ROS介导的Itch上调可能导致TXNIP降解，从而引起巨噬细胞中随后的NF-κB激活。}

Decreased TXNIP levels in COPD patients

临床样本分析显示，与不吸烟者相比，吸烟者的肺泡巨噬细胞和小气道上皮中ITCH基因表达较高，而TXNIP表达较低。在COPD患者肺组织中，TXNIP表达显著降低，而Itch表达升高。类似地，在COPD患者的支气管肺泡灌洗液细胞中观察到TXNIP表达降低。此外，从健康非吸烟者、健康吸烟者和COPD患者获得的外周血单个核细胞显示，轻度和重度COPD患者中TXNIP的抑制比健康供体显著更大。这些结果一致表明，持续的CS暴露或强氧化剂刺激可能增强Itch表达，进而促进TXNIP蛋白酶体降解和下游NF-κB激活。

研究结论表明，CS诱导的氧化应激触发MAPK激活和Itch表达，导致巨噬细胞中TXNIP降解。Itch依赖的TXNIP蛋白酶体降解促进NF-κB激活和炎症反应，可能促进COPD发病机制。使用ROS清除剂或Itch特异性敲低稳定TXNIP可减弱NF-κB介导的炎症，表明其作为COPD治疗的潜在治疗靶点。

这项研究的重要意义在于首次证实TXNIP下调与CS诱导的氧化应激和肺部炎症相关，揭示了ROS/Itch/TXNIP轴作为NF-κB激活的上游通路，为COPD相关炎症提供了额外的NF-κB启动途径。尽管COPD发病机制复杂且病因多样，但对该机制的详细研究将有助于未来的药物开发。针对氧化应激的治疗药物与其它抗炎药物的联合治疗可能是未来有前景的治疗方法。