利用Komagataella phaffii异源表达抗菌肽acidocin 4356靶向铜绿假单胞菌的优化策略及机制研究

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Heterologous expression and optimization of the antimicrobial peptide acidocin 4356 in Komagataella phaffii to target Pseudomonas aeruginosa

本研究针对多重耐药（MDR）病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染缺乏有效治疗手段的难题，开发了基于Komagataella phaffii酵母系统的抗菌肽acidocin 4356（ACD）异源表达平台。通过密码子优化、响应面法（RSM）优化培养条件（21°C, pH 6.24, 1.089%甲醇），使重组ACD（rACD）产量提升34.12%，并证实其可有效抑制铜绿假单胞菌生长（150 μg/mL时抑制率达58.29%，MIC50和MIC90分别为143.04和320.64 μg/mL）。该研究为规模化生产抗菌肽提供了新策略，对应对抗生素耐药性危机具有重要意义。

　　

在抗生素耐药性危机日益严峻的全球背景下，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为ESKAPE耐药病原体家族的重要成员，因其强大的固有耐药性和生物膜形成能力，已成为医院内感染的主要元凶。据预测，到2050年，抗菌素耐药性（AMR）可能导致每年1000万人死亡，这凸显了开发新型抗菌策略的紧迫性。抗菌肽（AMPs）因其广谱抗菌活性和不易诱导耐药性的特点，被视为传统抗生素的有力替代品。然而，高昂的生产成本和技术挑战严重限制了其临床应用。

在这项发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》的研究中，伊朗国家遗传工程与生物技术研究所的Ali Akbari团队将目光投向了acidocin 4356（ACD）——一种先前被证实对铜绿假单胞菌有效的抗菌肽。为了解决传统生产方法的局限性，研究人员开发了一种基于Komagataella phaffii（原名Pichia pastoris）酵母的异源表达系统，旨在实现ACD的经济高效规模化生产。

关键技术方法

研究团队首先对ACD基因进行密码子优化并克隆至pPICZα-A表达载体，通过电穿孔转化K. phaffii GS115菌株。利用响应面法（RSM）对温度、pH和甲醇浓度三个关键参数进行系统优化，以提升重组ACD（rACD）产量。通过Ni-NTA色谱和肠激酶消化纯化获得rACD，并采用AlphaFold进行结构预测。抗菌活性通过微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC₅₀/MIC₉₀）进行评估。

研究结果

ACD基因盒在K. phaffii GS115基因组中的整合

研究人员成功将重组pPICZα-ACD基因盒整合至K. phaffii GS115基因组中。菌落PCR证实了整合的正确性，重组菌落显示出Mut+表型，表明在AOX1基因位点发生了单交叉事件，保留了原始AOX1基因的同时引入了重组基因盒。

6×His-ECS-rACD肽的表达与纯化

在含1%甲醇的培养基中诱导4天后，梯度SDS-PAGE分析显示转化子1的培养上清液中存在独特的蛋白条带（约25-35 kDa），而对照菌株和转化子2中未观察到该条带。点印迹分析使用抗6×His抗体进一步验证了6×His-ECS-rACD肽的存在。通过Ni-NTA色谱纯化后，肠激酶消化去除了6×His-ECS标签，获得的rACD表观分子量约为20 kDa，高于理论预测的8.3 kDa，提示可能存在寡聚化或翻译后修饰。

ACD结构

AlphaFold结构预测显示ACD具有三个α螺旋，其中两个螺旋具有高pLDDT（预测局部距离差异测试）分值（70-90），表明预测可靠性高。这些α螺旋在肽与革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）结合中起关键作用。表面疏水性分析证实了肽与细菌膜相互作用的潜力。

pLDDT>70), yellow regions indicate moderate confidence(70>pLDDT>50),and orange regions represent low confidence(pLDDT<50).c Predicted aligned error(PAE)plot, showing alignment reli-ability between residues. The dark green diagonal represents residues aligned with them-selves, and low off-diagonal PAE values indicate accurate spatial predictions for residues in distinct helices. d Surface hydrophobicity analysis, with orange regions indicating areas of high hydrophobicity potentially involved in bacterial membrane disruption'>

6×His-ECS-rACD肽合成的优化

通过响应面法（RSM）对温度、pH和甲醇浓度进行优化，建立了可靠的回归模型（R2=99.8%）。在优化条件（21°C, pH 6.24, 1.089%甲醇）下，6×His-ECS-rACD肽的表达量比参考条件（30°C, pH 6, 1%甲醇）提高了34.12%。

rACD的抗菌特性

rACD对ESKAPE病原体表现出抗菌活性，其中对铜绿假单胞菌的敏感性最高。剂量反应实验显示，在150 μg/mL浓度下，rACD可使铜绿假单胞菌的生长减少58.29%。通过浓度梯度（50-350 μg/mL）和对数回归分析，计算出MIC₅₀和MIC₉₀值分别为143.04和320.64 μg/mL。

结论与讨论

本研究成功建立了K. phaffii GS115中ACD的异源表达平台，证实了其作为规模化生产抗菌肽的可行性。虽然天然ACD具有更高的生物活性，但重组变体在优化的酵母培养条件下产量更高，更适合商业化放大生产。通过响应面法系统优化培养条件，显著提高了rACD产量。rACD对铜绿假单胞菌表现出有效的抑制活性，尽管其MIC值高于天然ACD，但仍显示出对抗这种 notorious 耐药病原体的潜力。

该研究首次深入探讨了酵母系统中抗菌肽生产的潜力与限制，为利用异源表达开发抗菌肽提供了重要见解。未来研究应进一步评估替代表达系统，阐明ACD的构效关系，最终推动这种有前景的抗菌剂在对抗多重耐药病原体方面的临床和商业潜力。

研究结果强调了K. phaffii作为抗菌肽生产的稳健平台的价值，并突出了rACD作为对抗MDR铜绿假单胞菌的有效制剂的治疗潜力，值得进一步研究其临床和工业应用。