牛胸腺肽制剂的理化特性与免疫调节潜力评估：TFX? API与新制剂的比较研究

《International Journal of Peptide Research and Therapeutics》：Evaluation of the Physicochemical Properties and Potential Immunomodulatory Effects of Bovine Thymic Peptide-Based Preparations

本研究针对胸腺肽制剂成分复杂、功能表征不足的问题，系统评估了两种新型牛胸腺肽制剂（Pa、Pb）与已上市活性药物成分TFX? API的理化特性及免疫调节活性。研究发现Pa制剂能显著抑制NF-κB通路且无细胞毒性，其独特的氨基酸组成和热稳定性表明其作为功能性免疫调节成分的开发潜力，为胸腺肽制剂的标准化评价提供了重要参考。

　　

在免疫调节治疗领域，胸腺作为中枢免疫器官的重要性不言而喻。它不仅是T细胞发育成熟的摇篮，更通过分泌多种胸腺肽类物质调控机体免疫应答。然而，尽管胸腺肽制剂已在临床使用数十年，其复杂的成分构成与精确的作用机制仍如迷雾般亟待揭开。特别是对于含有多种活性成分的胸腺提取物，由于缺乏系统的理化特性表征和功能验证，严重制约了其标准化进程和应用拓展。

近日发表于《International Journal of Peptide Research and Therapeutics》的研究论文，由Monika Besman等学者携手完成，对两种新型牛胸腺肽制剂（Pa和Pb）进行了全面评估，并与已获批的活性药物成分Thymus Factor X?（API TFX）进行对比。这项研究不仅揭示了不同制备工艺对胸腺肽制剂特性的深远影响，更发现了一种具有显著免疫调节活性且安全性优异的新型制剂候选物。

研究团队采用多学科交叉的技术路线，综合运用了一系列关键技术方法。通过基本的化学成分分析（凯氏定氮法、索氏提取法等）评估了制剂的蛋白质、脂肪和灰分含量；采用SDS-PAGE和色谱技术（RP-HPLC、SEC-HPLC）解析了肽段分子量分布和疏水性特征；通过氨基酸分析仪确定了各制剂的氨基酸组成；利用差示扫描量热法（DSC）评估了热稳定性；最后通过NF-κB报告基因实验和细胞活力检测，在THP-1单核细胞模型上评价了免疫调节活性和生物安全性。

基本理化特性表征

研究显示，三种制剂在基本理化性质上存在显著差异。API TFX和Pb在水中的溶解性良好，而Pa仅微溶，这一特性可能影响其生物利用度和制剂开发。蛋白质含量方面，API TFX最高（87.12%），Pa次之（85.13%），Pb最低（73.15%）。尤为值得注意的是，Pb的灰分含量高达12.26%，远高于其他两者，提示可能存在无机盐残留。pH测定显示，API TFX和Pa的1%水溶液pH为3.9，而Pb为5.7，这些基础数据为制剂配方设计提供了重要参考。

蛋白肽谱分析

SDS-PAGE电泳结果清晰展示了三种制剂的分子量分布特征。API TFX主要包含分子量低于10 kDa的肽段，与文献报道的胸腺肽特征一致。Pa制剂则显示出更广泛的分子量分布（约3-25 kDa），在25 kDa和15 kDa处有明显的条带，同时包含大量低于10 kDa的组分，表明其成分更为复杂。Pb制剂在低分子量区域（<6.5 kDa）呈现弥散条带，提示其主要由小分子肽段或降解片段组成。这些发现为理解不同制备工艺对终产物组成的影响提供了直观证据。

色谱分析

RP-HPLC分析进一步揭示了各制剂的疏水性特征。Pa显示出四个主要峰，其中保留时间25.68分钟的峰强度最高；Pb仅有两个早期洗脱峰（4.47和4.95分钟），表明其主要由亲水性小肽组成；API TFX则在2.5-9分钟出现宽泛的早期洗脱区域，包含多个重叠峰，同时在25.5分钟有一个独立峰，反映了其复杂且以低分子量组分为主的特性。

SEC-HPLC分析表明，API TFX在20-35分钟有宽泛洗脱范围，主峰约30分钟；Pb在30-55分钟洗脱，主峰约40分钟；Pa在22-35分钟出现多个峰，主峰在25和31分钟。与胸腺素前体α（ProTα，约12 kDa）标准品对比，Pa与API TFX的洗脱峰有部分重叠，而Pb则完全不含此组分，这与SDS-PAGE结果相互印证。

氨基酸组成分析

氨基酸分析显示，Pa富含谷氨酸（13.2%）、脯氨酸（12.06%）和天冬氨酸（9.20%）；API TFX以脯氨酸（21.1%）、赖氨酸（15.8%）、甘氨酸（15.2%）和谷氨酸（10.1%）为主；Pb则特别富含谷氨酸（18.9%）和赖氨酸（9.1%），脯氨酸含量相对较低（5.95%）。这些氨基酸组成差异直接影响肽段的二级结构和生物活性。

按侧链理化性质分组分析显示，三种制剂在带正电荷、带负电荷、极性、脂肪族或芳香族残基比例上虽有一些数值差异，但仅芳香族残基组中Pa与API TFX存在显著差异（p<0.05）。这种氨基酸组成特征与已知免疫调节肽的构效关系相符，为解释其生物活性提供了分子基础。

热稳定性分析

DSC分析显示，API TFX有两个吸热转变峰（66.6±1.9°C和96.1±6.3°C），表明存在多个热稳定且结构明确的肽段组分。Pa也显示两个热事件（65.3±2.9°C和111.3±1.0°C），但焓值较低，提示其结构有序性适中。Pb仅显示一个宽泛的吸热峰（90.6±2.2°C），表明其组分均一性较差。API TFX表现出最高的热稳定性，这与药品级产品的要求一致。

免疫调节活性与细胞毒性

最令人瞩目的发现来自免疫调节活性评价。在THP-1-Blue? NF-κB报告基因实验中，三种制剂均显示出对NF-κB通路的抑制作用。Pa表现出最强的浓度依赖性抑制效应，在0.001、0.1和10 μg/mL浓度下，SEAP活性分别降低至88%、75%和67%（p<0.001）。API TFX呈现U型剂量反应曲线，低浓度（0.001 μg/mL）和高浓度（10 μg/mL）均产生抑制作用（SEAP活性分别为85%和81%），而中间浓度（0.1 μg/mL）无显著效应。Pb的抑制作用最弱（p<0.05）。

细胞毒性实验显示，Pb在10 μg/mL时产生显著细胞毒性（*p<0.001），而Pa和API TFX在所有浓度下均无毒性。这一结果明确表明，NF-κB活性的降低并非由细胞毒性引起，而是真正的免疫调节效应。

研究结论与意义

本研究通过系统性的理化表征和功能评价，揭示了不同制备工艺对胸腺肽制剂特性的深刻影响。尽管API TFX和实验制剂（Pa、Pb）在制备工艺和纯化步骤上存在差异，但本研究为评估胸腺肽制剂提供了一个全面的分析框架。

研究结果表明，Pa制剂虽然水溶性较差，但其平衡的氨基酸组成、广泛的分子量分布以及优异的NF-κB抑制活性（且无细胞毒性），使其成为功能型免疫调节营养剂的理想候选。API TFX作为药品级原料药，表现出最高的热稳定性和明确的生物活性，继续作为胸腺肽制剂的参考标准。而Pb制剂尽管在理化性质上与API TFX相似且富含小分子肽，但其在高浓度下的细胞毒性限制了其直接应用价值。

这些发现强调了理化特性表征在预测肽类制剂生物潜能方面的重要性。特别是Pa制剂，其良好的功效与安全性指标支持其作为免疫调节营养剂的进一步开发。当然，其长期安全性仍需通过体内研究验证，其具体活性成分需通过质谱等技术进一步鉴定。

该研究为胸腺肽制剂的标准化和质量控制提供了重要科学依据，也为开发新型免疫调节剂指明了方向。在个性化医疗和精准营养日益受到重视的今天，这种基于理化特性与生物功能相结合的评价模式，将为复杂天然产物的开发应用提供有益借鉴。