单细胞测序揭示RACK1通过抑制FOXO信号通路驱动胰腺癌转移的分子机制

《Hormones & Cancer》：Molecular mechanisms of RACK1-driven metastasis in pancreatic ductal adenocarcinoma revealed by single-cell RNA sequencing

本研究针对胰腺导管腺癌(PDAC)高异质性和早期转移的临床难题，通过整合单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据构建细胞图谱，发现导管细胞是PDAC恶性细胞的主要来源，并鉴定出高恶性亚型Ductal cell-3。研究证实RACK1在该亚型中显著高表达，且与淋巴结转移、临床分期及预后不良显著相关。功能实验表明RACK1通过抑制FOXO信号通路促进上皮-间质转化(EMT)，从而驱动PDAC进展和转移。该研究为PDAC的早期诊断和靶向治疗提供了新思路。

　　

胰腺导管腺癌(PDAC)是恶性程度最高的消化道肿瘤之一，其5年生存率始终低于10%，被称为"癌中之王"。这种严峻的预后主要归因于两个关键临床难题：一是早期诊断困难，超过80%的患者确诊时已失去手术机会；二是肿瘤异质性极高，导致治疗抵抗和早期转移。尽管近年来癌症诊疗技术取得了长足进步，但PDAC患者的生存率并未得到显著改善，这促使研究人员从新的角度探索其发病机制。

传统的组学研究方法难以揭示PDAC细胞水平的异质性特征。随着单细胞测序技术的发展，科学家们得以在单个细胞分辨率下解析肿瘤微环境的复杂性。Liu等研究人员在《Discover Oncology》上发表的最新研究，通过整合多个单细胞RNA测序数据集，构建了涵盖正常胰腺组织、原发PDAC肿瘤和肝转移组织的全面细胞图谱，为理解PDAC的恶性进展机制提供了新的视角。

研究人员主要运用了单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术分析106330个细胞，通过主成分分析(PCA)和UMAP降维可视化进行细胞分群和注释；利用inferCNV和copyKAT算法计算拷贝数变异(CNV)以区分恶性细胞；采用Monocle2进行伪时间轨迹分析；通过TCGA数据库进行临床数据验证；使用RT-qPCR、免疫组化、免疫荧光等分子生物学技术验证基因表达；通过细胞功能实验（克隆形成、划痕愈合、Transwell侵袭实验）评估基因功能；进行RNA-seq测序和生物信息学分析（GO/KEGG富集分析）探索分子机制。研究样本包括公共数据库的单细胞数据集和61例大连医科大学附属第一医院的手术切除PDAC患者组织。

2.1 单细胞转录组图谱揭示PDAC细胞多样性

通过整合分析正常胰腺组织、原发PD发PDAC肿瘤和肝转移组织的单细胞数据，研究人员成功构建了包含106330个细胞的转录组图谱。UMAP降维分析识别出17个主要细胞簇，通过经典细胞标志物进一步将其注释为9种细胞类型：T细胞（CD3E⁺）、星状细胞（RGS5⁺）、巨噬细胞（AIF1⁺）、导管细胞（CFTR⁺）、内皮细胞（CDH5⁺）、腺泡细胞（CPA1⁺）、成纤维细胞（COL3A1⁺）、B细胞（MS4A1⁺）和肥大细胞（TPSB2⁺）。组织来源分析显示，导管细胞在三种组织中均有显著代表性，提示其在PDAC发生发展中的核心地位。

CNV分析显示，导管细胞的染色体拷贝数变异水平显著高于其他细胞类型，表明导管细胞是PDAC中恶性细胞的主要来源。这一发现为后续聚焦导管细胞异质性的研究奠定了理论基础。

2.2 导管细胞异质性及恶性亚型鉴定

为进一步解析导管细胞在PDAC进展中的异质性，研究人员对导管细胞进行了亚群分析。PCA分析识别出三个导管细胞亚型：Ductal cell-1、Ductal cell-2和Ductal cell-3。CNV分析显示Ductal cell-2和Ductal cell-3的染色体不稳定性显著高于Ductal cell-1。值得注意的是，Ductal cell-3在正常胰腺组织中几乎不存在，主要来源于PDAC组织和肝转移灶，提示该亚型与肿瘤恶性进展密切相关。

差异表达分析发现，RACK1是Ductal cell-3中最显著上调的基因之一。功能富集分析显示，Ductal cell-3中上调的基因主要富集在癌症相关通路，如纤维蛋白溶解、创伤反应负调控等。伪时间轨迹分析进一步表明，RACK1的表达在导管细胞分化后期显著上调，主要集中于Ductal cell-3亚型，提示RACK1在PDAC恶性进展中的重要作用。

2.3 RACK1的临床意义

通过TCGA数据库分析，研究人员发现RACK1在PDAC组织中的表达显著高于正常胰腺组织。泛癌分析显示，RACK1在多种癌症组织中均呈现上调趋势，表明其癌基因功能的普遍性。生存分析表明，RACK1高表达与PDAC患者不良预后显著相关。

实验验证方面，RT-qPCR检测显示PDAC组织中RACK1 mRNA水平显著高于癌旁组织。免疫组化分析51对PDAC样本进一步证实了RACK1蛋白在肿瘤组织中的高表达。临床病理关联分析发现，RACK1高表达与组织学分化差、淋巴结转移和TNM分期晚显著相关，提示RACK1可作为PDAC恶性进展的生物标志物。

2.4 RACK1对PDAC细胞功能的影响

为探究RACK1的生物学功能，研究人员在PANC-1细胞中进行了基因敲低和过表达实验。克隆形成实验显示，敲低RACK1显著抑制细胞增殖能力，而过表达RACK1则促进细胞增殖。划痕愈合和Transwell实验结果表明，RACK1敲低可抑制细胞迁移和侵袭能力，而过表达RACK1则增强这些恶性表型。

2.5 RACK1调控机制探索

RNA-seq分析发现，RACK1敲低导致806个基因上调和532个基因下调。差异基因中包含多个EMT相关基因，如CDH1、FOXO1、MMP1、LAMC2等。GO富集分析显示，差异基因显著富集于内胚层形成、细胞外基质组织等EMT相关生物学过程。KEGG通路分析表明，FOXO信号通路是RACK1调控的最显著通路之一。

分子机制验证实验显示，RACK1敲低后FOXO1和E-cadherin表达上调，而N-cadherin和Vimentin表达下调。相反，RACK1过表达则呈现相反趋势。这些结果提示RACK1通过抑制FOXO信号通路促进EMT进程。

本研究通过整合多组学数据，首次在单细胞水平系统揭示了PDAC中导管细胞的异质性特征，并鉴定出高恶性亚型Ductal cell-3。研究证实RACK1是该亚型的关键驱动基因，其高表达与PDAC临床病理特征和预后不良显著相关。机制研究表明，RACK1通过抑制FOXO信号通路促进EMT进程，从而驱动PDAC的进展和转移。

该研究的创新点在于首次将单细胞测序技术与临床功能验证相结合，阐明了RACK1在PDAC恶性进展中的具体作用机制。研究发现不仅为理解PDAC异质性和转移机制提供了新视角，也为开发针对RACK1-FOXO信号轴的新型靶向治疗策略奠定了理论基础。尽管研究存在样本来源限制和技术层面的局限性，但其整体研究框架和发现对改善PDAC患者预后具有重要的转化医学价值。

未来研究可进一步探索RACK1在不同细胞类型中的特异性功能，结合空间转录组技术解析其在肿瘤微环境中的空间分布特征，并开发针对该通路的特异性抑制剂，为PDAC的精准治疗提供新途径。