综述：评估髓系和前体细胞肿瘤的骨髓环钻活检实用诊断方法：中欧现状的反映

《Journal of Hematopathology》：Practical diagnostic approach to assess myeloid and precursor cell neoplasms on trephine bone marrow biopsies: reflection of middle European reality

本综述由中欧血液病理学专家撰写，针对骨髓环钻活检（TBMB）在髓系肿瘤诊断中的核心地位，系统阐述了在辅助检查受限的现实场景下，如何通过优化TBMB处理流程（如10%缓冲福尔马林固定、EDTA脱钙）、综合运用组织病理学、免疫组织化学（IHC）、荧光原位杂交（FISH）及高通量测序（HTS）等技术，实现对各类髓系肿瘤（MPN、MDS、AML等）及前体细胞肿瘤（如BPDCN）的精准诊断。文章提供了详尽的IHC抗体组合建议（见表1），并强调了整合多学科信息对于改善患者诊疗的重要性。

　　

引言

骨髓环钻活检（TBMB）是诊断血液系统疾病多模式流程中的重要组成部分。理想情况下，应整合血液计数（CBC）、涂片细胞学、流式细胞术、细胞遗传学和分子遗传学结果，出具综合报告。然而，现实情况是，诊断性（血液）病理学家常常面临诸多障碍，可能仅能获得CBC结果，或其他技术无法实施、样本未送至专业实验室、或检测失败（如干抽或核酸降解）。此时，TBMB便成为唯一的分析样本。本文旨在详述在髓系和前体细胞肿瘤诊断中，如何利用TBMB进行全面的诊断分析，包括经典组织病理学、免疫组织化学（IHC）、荧光原位杂交（FISH）和测序技术，以得出更明确、可靠的结论，从而改善患者护理。

TBMB的最佳处理流程

为保持生物大分子（蛋白质、DNA、RNA）的诊断分析完整性，TBMB必须经过恰当固定和脱钙。尽管有多种固定剂和脱钙方法，但首选方案是使用10%缓冲福尔马林（即3.7-4%甲醛，pH 7.4）固定8-72小时，并使用10-14%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙8（机器辅助）至72小时。除标准H&E染色外，常规组织化学染色包括Gomori（评估嗜银纤维化，MF）、Giemsa（评估红系、嗜碱性粒细胞和浆细胞）、PAS（更好地评估巨核系和粒系），以及特定情况下的Masson三色（评估胶原沉积和骨硬化）和Turnbull染色（检测亚铁离子）。结合IHC、ISH和基因测序（包括HTS）技术，已成为许多髓系肿瘤的诊断标准，并可通过TBMB实现。

各类髓系和前体细胞肿瘤的诊断要点

结合临床背景（如脾脏大小、症状持续时间、用药史）、CBC和组织形态学，可初步怀疑一系列髓系和前体细胞肿瘤，包括骨髓增殖性肿瘤（MPN）、骨髓增生异常综合征（MDS）、骨髓增生异常-骨髓增殖性肿瘤（MDS/MPN），伴或不伴系统性肥大细胞增多症（SM）、SM本身、伴嗜酸性粒细胞增多和酪氨酸激酶基因融合的髓系/淋巴样肿瘤（M/LN-Eo-TKGF）、前体细胞肿瘤（如急性髓系白血病AML、急性淋巴细胞白血病ALL）或母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤（BPDCN）。为达成特异性诊断，需在诊断性TBMB上进行大量辅助性原位和体外检测。

骨髓增殖性肿瘤（MPN）

MPN的诊断，尤其在晚期骨髓纤维化（MF）情况下，主要依赖于TBMB的组织病理学评估，因为BM细胞常被困在纤维网络中无法抽吸。事实上，TBMB评估是诊断所有MPN的主要标准之一。形态学上，许多病例表现为BM高细胞性，三系细胞均可见成熟。在慢性粒细胞白血病（CML）中，粒系极度增生伴侏儒巨核细胞增多是诊断线索；而区分其他类型MPN与反应性改变或彼此之间则可能更具挑战性。在原发性血小板增多症（ET）中，BM细胞量应在年龄调整范围内，其形态学标志是散在分布的“鹿角状”高度分叶巨核细胞，不应出现大于7个的巨核细胞簇。若出现巨核细胞簇且巨核细胞形态多变（包括低分叶和深染“云雾状”核），应考虑纤维化前原发性骨髓纤维化（pre-PMF）的鉴别诊断。在真性红细胞增多症（PV）中，BM呈显著高细胞性（全髓增生），三系均增生。可能出现小巨核细胞簇。在任何MPN中，应根据既定标准对纤维化进行分级。对于已知MPN病例出现新发贫血、血小板减少、单核细胞增多或外周血原始细胞增多时，应通过TBMB排除MF进展、MDS或MDS/MPN样演变及转化。在怀疑MPN时，应用ISH排除/检测BCR::ABL1融合，结合突变特异性抗钙网蛋白抗体CAL2和提示JAK2和/或MPL突变的抗磷酸化STAT5抗体（见图1），并对相应基因进行测序，以及CSF3R突变测序（以排除CNL），可在大多数情况下建立实体特异性诊断。CEL需要额外检测以特别排除SM和M/LN-Eo-TKGF。鉴别诊断方面，多种药物诱导的造血改变可能模拟MPN，主要包括血小板生成素激动剂、G-CSF和EPO的应用。

骨髓增生异常综合征（MDS）

MDS是原因不明血细胞减少症（除伴血小板增多的del(5q) MDS外）最重要的鉴别诊断。然而，仅凭形态学诊断是困难的。在TBMB上，有经验的血液病理学家可以评估巨核细胞异型性和红系病态造血（见图2a）。异型巨核细胞可表现为低分叶和深染核；微小巨核细胞也是病态造血的强指征。红系病态造血反映为红系前体细胞核轮廓不规则或有核突起。TBMB还可评估造血细胞空间分布紊乱，例如骨旁巨核细胞和粒系从骨旁区向中央区的移位。但需注意，这些改变几乎都可由毒性或药物暴露或维生素缺乏引起。值得注意的是，在伴纤维化的MDS（WHO-5确认为特定亚型）中，由于干抽，完整诊断可能再次依赖于TBMB。对于疑似MDS的进一步评估，通过CD34 IHC评估原始细胞是否存在是强制性的，因为这可将病例分组（原始细胞>5-10%和>10-20%），这对患者预后和治疗选择具有重大影响。建议计数500至1000个细胞中CD34阳性细胞（与原始细胞一致）的百分比，并报告热点中的存在和计数。CD34还有助于检测不成熟前体异常定位（ALIP）（见图2b）。巨核细胞表达CD34也是病态造血的特征。检测p53表达增加可能提示TP53突变。强p53表达超过2% BM细胞可作为阈值参考，但需注意在TP53无义和某些移码突变导致p53蛋白完全缺失时，IHC可能出现假阴性。从FFPE TBMB中提取DNA可靠地检测MDS相关突变可支持MDS怀疑，但需注意CHIP和CCUS的鉴别诊断。由于两个MDS亚型由SF3B1或TP53突变定义，至少对这两个基因进行检测是强制性的。在SF3B1突变病例中，伴环状铁粒幼细胞的表现可能是有用的提示。有时，如果仅有TBMB，反应性改变很难与MDS相关改变区分。在此类病例，尤其是低原始细胞计数者，应添加评注，提示必须结合患者药物暴露史以及BM细胞学（仅在此可充分评估粒系病态造血）、流式细胞术（Ogata评分）和遗传学分析（突变和结构染色体畸变）结果。

骨髓增生异常-骨髓增殖性肿瘤（MDS/MPN）

在MDS/MPN重叠综合征中，可见骨髓增殖性（血细胞增多、高增殖造血细胞）和骨髓增生异常性（血细胞减少、巨核细胞和红系前体细胞异型性、粒系成熟障碍）特征，程度各异。与CBC的相关性对于不遗漏慢性粒-单核细胞白血病（CMML）病例至关重要；该实体的另一线索是成熟的浆细胞样树突状细胞形成结节状聚集，可通过CD123和/或IRF8的IHC检测到（见图3）。BM中单核细胞增多可通过CD11c、CD14或CD68染色验证，其中CD14效果最佳。通过仔细评估IRF8染色切片中显示弱核阳性的细胞，可粗略估计单核母细胞等效值。重要的是，TBMB发现已被确认为CMML的诊断标准。在所有CMML（和MDS/MPN，非特指）病例中，还应排除SM（见下文），因其可能表现为非常细微的浸润，仅凭形态学难以检测。在遗传学水平，TET2和SRSF2（CBL, SETBP1）突变或多重TET2共突变强烈提示CMML，而同时存在ASXL1和SETBP1突变、无MPN驱动变异、无单核细胞增多且粒系造血明显占主导则提示不典型慢性粒细胞白血病（aCML）/伴中性粒细胞增多的MDS/MPN。最后，具有RAS家族共突变的MPN驱动突变病例（尤其是高变异等位基因频率者）怀疑为伴MPN/MDS样进展的MPN，并且MPN或MDS病史倾向于排除某些MDS/MPN亚型，如MDS/MPN-T-SF3B1和非特指型。在其他类型的MPN/MDS中，仅凭TBMB评估无法诊断，因为要么需要特定的遗传学改变（如SF3B1突变）进行诊断，要么必须满足无法在TBMB上评估的标准（如特定类型的成熟障碍或病态造血）。除了分类为谱系MPN/MDS重叠的病例外，还应考虑具有MPN样特征的MDS进展和出现新发增生异常或MDS/MPN特征的MPN进展。特别是在后一类中，MPN的典型特征（PMF样巨核细胞伴晚期MF和骨硬化）可在TBMB中轻易检测到。CD34（排除原始细胞增多和检测扩大的血窦内窦内造血）、CD61（检测微小巨核细胞和簇）、p53（反映TP53改变，作为疾病进展的指标）、突变钙网蛋白和磷酸化STAT5（检测[大多数]巨核细胞核表达作为MPN驱动突变的读数）的IHC染色有助于这些活检的评估。反应性单核细胞增多是CMML的重要鉴别诊断。其他相关鉴别诊断包括噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH）、肉芽肿性和感染性疾病（利什曼病、组织胞浆菌病等），这些都可能伴单核细胞增多，应予以考虑。

急性髓系白血病（AML）

在许多病例中，AML的形态学诊断相当直接，因为原始细胞的弥漫性增加（在许多情况下远超正常造血量）可以轻易看到。然而，应仔细检查背景中的造血情况，因为病态造血可能提示背景为MDS的AML的鉴别诊断，这可能预示着特殊的临床病程，并且可能伴随其他疾病，如SM（尤其在具有RUNX1::RUNX1T1融合的AML中）或浆细胞肿瘤。通过免疫组织化学表征原始细胞至关重要。许多AML病例表达CD34，并且也对髓系标志物如CD117和髓过氧化物酶（MPO）呈阳性。然而，具有单核细胞分化的病例CD34为阴性。此时，IRF8等单核母细胞标志物，连同其他（主要）单核细胞标志物（CD11c, CD14, CD56, CD68）可能有帮助。然而，免疫组织化学表征也可能存在一些陷阱：在常见的AML伴NPM1突变亚型（通常也表现出一定程度的单核细胞分化）中，CD34 consistently为阴性；此时，使用突变特异性NPM1抗体已被证明非常有用，它也可用作检测微小残留病的敏感方法（见图4a）。应用突变特异性抗体是首选，因为它能识别A、B、D型突变中863/864位点4个碱基对插入的结果，且不识别普遍存在的野生型蛋白，从而无需特异性亚细胞（胞浆）检测可能突变的蛋白（否则需要与野生型核蛋白区分，这在胞浆稀少的原始细胞中非常困难甚至不可能）。在伴RUNX1改变的AML中，原始细胞可显示CD19、CD79a和/或PAX5表达，这可能导致怀疑B-ALL或混合表型急性白血病（MPAL）。在这种情况下，应寻求进一步的髓系（MPO, CD33, CD117）和淋巴系标志物（CD20, CD22），以及流式细胞术结果和突变分析的相关性，以解决这一困境。同样，弱MPO表达可见于少数B-ALL病例。AML原始细胞也可表达CD123，这需要与浆细胞样树突状细胞增多或母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤（BPDCN）相鉴别。在CD123表达的AML中，IHC检测到突变NPM1且其他BPDCN标志物（见下文）阴性，是此鉴别诊断的有用工具。在任何AML病例中，应将涂片结果与TBMB上获得的原始细胞等效数进行比较。特别是在技术不可评估的情况下，TBMB上的原始细胞等效数必须进行计数。几种由CEBPA、NPM1、TP53或MDS相关突变定义的AML亚型的诊断基于测序结果（见图4b），而其他突变（如IDH1或IDH2）与药物敏感性相关，因此在相应情况下必须应用HTS，这对于FFPE材料是可行的，在特定情况下（如上述段落所述）可能是DNA的唯一来源。高效地，突变特异性抗NPM1抗体PA1-46356能够识别这种最常见的AML类型。

系统性肥大细胞增多症（SM）

SM在形态学上常表现为细微的骨旁或较少见的间质上皮样或梭形细胞浸润。在TBMB和/或其他髓外器官活检中检测到>14个肥大细胞聚集是SM的主要诊断标准。在Giemsa染色中，肥大细胞可通过其颗粒被识别；然而，肥大细胞也可能脱颗粒，因而更难识别。因此，强烈建议应用类胰蛋白酶（MCT）和CD117的辅助IHC。在任何髓系肿瘤，尤其是CMML、MDS/MPN非特指和AML RUNX1::RUNX1T1中，必须仔细检查TBMB以排除伴随的SM。CD2、CD25和CD30的异常表达以及KIT突变是SM诊断的次要标准，可通过TBMB分析获得（见图5a）。特别是在仅有细微SM浸润的病例中，使用敏感技术（如微滴式数字PCR）进行KIT测序分析，可以检测到变异等位基因频率<0.1%的激活KIT突变（见图5b）。

伴嗜酸性粒细胞增多和酪氨酸激酶基因融合的髓系/淋巴样肿瘤（M/LN-Eo-TKGF）

特别是在表现为伴嗜酸性粒细胞增多、单核细胞增多、MF、肥大细胞（甚至CD25+）和/或淋巴母细胞过多的髓系肿瘤的男性患者，伴有髓外髓系增殖（淋巴结和/或髓系肉瘤）时，应怀疑M/LN-Eo-TKGF。不幸的是，其形态学相当不特异（见图6a），与临床数据和CBC的相关性至关重要。在TBMB中，大多数病例呈现显著的嗜酸性粒细胞增多、粒系为主的造血、细微的巨核细胞系病态造血改变和MF。一个例外是“红系微小肿瘤”的存在（尤其在嗜酸性粒细胞增多、MF、男性、MPN或MDS/MPN样表现的背景下），这几乎是病征性的，应提示怀疑为伴PCM1::JAK2融合的M/LN-Eo（见图6b）。可进行进一步的免疫组织化学分析以更好地评估造血细胞系、病态造血改变和原始细胞（髓系和淋巴系）过多。为建立M/LN-Eo各种亚型的具体诊断，必须应用敏感的基于RNA的分子检测来检测相应的酪氨酸激酶基因融合，因为仅凭形态学，鉴别诊断范围仍然很广，包括MPN、MDS/MPN、ALL、SM和CEL。

母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤（BPDCN）

BPDCN除了累及皮肤外，大多数病例在初次就诊时已累及BM。肿瘤细胞形态多样，从不规则核的单核样细胞到小母细胞样和较大的免疫母细胞样细胞（尤其在MYC重排病例中）不等。在疑似病例和任何CD123阳性髓系肿瘤中，应通过应用CD3、CD20、CD34、溶菌酶和MPO（必须为阴性）以及CD4、CD56、CD68、CD123、CD303、CD304、IRF8、SOX4、TCL1、TCF4和TdT（其中至少两个应为阳性）的IHC来排除BPDCN（见图7）。如果“母细胞性浆细胞样树突状细胞”表达突变NPM1或经测序为NPM1突变，则应将其分类为伴NPM1突变的AML原始细胞。此外，在多种T细胞淋巴瘤、MDS、AML以及典型的CMML中可见较成熟的浆细胞样树突状细胞增多，在后三者中其为克隆的一部分。

急性淋巴细胞白血病（ALL）

与AML类似，大多数ALL的诊断是直接的，因为弥漫性母细胞样细胞浸润。与髓系原始细胞相比，其染色质更致密，核仁不明显。原始细胞的表型表征对于正确诊断至关重要。除CD34外，大多数ALL病例表达TdT。这些标志物也有助于排除可模仿ALL的成熟淋巴瘤浸润，例如伯基特淋巴瘤或高级别B细胞淋巴瘤非特指，它们缺乏表达，尤其是CD34。在任何疑似ALL中，应评估B细胞或T细胞谱系特异性标志物：T细胞谱系表达CD2、CD3、CD5、CD7、TCRβF1或δ（单独或组合）；B细胞谱系表达CD19、CD20、CD22、CD79a或PAX5。为避免潜在的诊断陷阱，重要的是注意B-ALL中允许弱MPO染色，早期T前体ALL（ETP-ALL）中允许弱CD79a表达和CD117，AML原始细胞可表达CD2和CD7，并且RUNX1突变或易位的AML可表达CD19、CD79a和/或PAX5。最后一步，应建立WHO-5/ICC 2022诊断，这将需要表型和基因型研究，但亚型特异性诊断可能无法通过TBMB可用的诊断工具实现/达成。在评估TdT IHC染色时，大量 hematogones（也为TdT和B细胞标志物阳性）可能会误导怀疑B-ALL或在随访中怀疑B-ALL复发。Hematogones是B细胞的前体，大多弥漫分布于BM中，不形成较大簇。形态上，它们与淋巴母细胞非常相似。尽管淋巴母细胞和hematogones的免疫表型相似，但后者通常对标志物显示渐变/非均匀染色，CD34（细胞数量最少）、TdT、CD20和PAX5（细胞数量最多）的染色比例递增，这已被描述为区分hematogones与B-ALL原始细胞的线索。此外，B-ALL原始细胞的异常标志物表达以及遗传学分析可以确认为hematogones而非B-ALL原始细胞，例如在随访中。在小母细胞样B细胞背景下，CD34、CD99、细胞角蛋白、ERG、弱MPO、NUT1和SOX11的表达提示病理性不成熟表型，有助于区分肿瘤性前体细胞与hematogones和成熟淋巴瘤；而在T细胞相同背景下，这些标志物是BCL11B、CD1a、CD10、CD34、CD117、LMO2、NOTCH1（见图8）、TTF1（基因NKX2.1）和PU.1（基因SPI1）。

结论

TBMB是实现血液肿瘤充分诊断的基本要件之一。本综述指出了TBMB处理的一些特定要求，并分享了多个诊断要点和陷阱，重点关注髓系和前体细胞肿瘤。尽管仅从TBMB中即可获得大量信息，但必须强调BM评估的整合性，其中不同支柱并非孤立存在。这种方法虽然在许多国家尚未成为现实，但通过达成正确诊断并为适当治疗打开大门，为患者护理带来了最大益处。