铁皮石斛源碳点纳米酶通过协同调控肠道黏液-上皮-免疫屏障缓解结肠炎

《Advanced Science》：Dendrobium Officinale-Derived Carbon Dots Nanozymes Alleviate Colitis by Orchestrating Intestinal Mucus-Epithelium-Immune Barriers

本研究创新性地利用中药铁皮石斛合成具有抗氧化酶活性的碳点（DO-CDs），系统阐明了其通过清除活性氧（ROS）、抑制M1巨噬细胞极化、下调促炎因子表达，并在急慢性结肠炎模型中展现多模式屏障修复功能。DO-CDs可显著恢复结肠长度、促进杯状细胞增殖与黏蛋白表达、上调紧密连接蛋白（如ZO-1、Occludin、Claudin-1），并通过调节树突状细胞/M1巨噬轴重建Th1/Treg平衡，为天然产物衍生碳点作为多靶点IBD治疗剂提供了机制基础。

　　

引言

炎症性肠病（IBD）是一种由遗传易感性、免疫失调和肠道屏障功能障碍驱动的慢性炎症性疾病。当前疗法主要针对免疫抑制，但在屏障修复方面疗效有限。纳米材料已成为IBD治疗中多维肠道屏障修复的创新策略。碳点（CDs）作为一种新型零维光致发光纳米材料，具有尺寸小、表面功能基团丰富、生物相容性好等优势。本研究选用具有益胃生津功效的中药铁皮石斛（Dendrobium officinale）作为前体，通过水热法合成碳点（DO-CDs），并探究其通过协调肠道黏液-上皮-免疫屏障缓解结肠炎的潜力。

DO-CDs的合成与表征

以铁皮石斛为碳源，通过简单水热法合成了DO-CDs。透射电子显微镜（TEM）显示DO-CDs分散良好，呈准球形，平均直径为1.3±0.3纳米。高分辨率TEM显示晶格条纹间距为0.23纳米，与石墨的（100）晶面一致，表明其具有类石墨晶体结构。原子力显微镜（AFM）证实了DO-CDs的单分散性，其高度与平均粒径一致。Zeta电位在7天内无显著变化，表明其具有良好的稳定性。紫外-可见吸收光谱在280纳米处显示吸收带，归属于sp²杂化结构的π-π*跃迁。在350纳米最佳激发下，荧光光谱显示发射峰位于438纳米。拉曼光谱在1335.11厘米^-1（D带）和1565.07厘米^-1（G带）处显示特征峰，I(D)/I(G)比为1.19，表明其表面富含缺陷和杂化基团。X射线衍射（XRD）分析显示在22°处有一个宽衍射峰，对应于石墨碳的（002）晶面。核磁共振氢谱（¹H NMR）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和X射线光电子能谱（XPS）分析证实DO-CDs表面富含氨基、羧基、羰基等官能团，这些结构特征可能赋予其潜在的药理活性和催化性能。

DO-CDs的抗氧化能力

通过ABTS、超氧阴离子（·O_2?）、羟基自由基（·OH）和DPPH·自由基清除实验评估了DO-CDs的总抗氧化能力。结果表明，DO-CDs表现出优异的整体抗氧化活性，其超氧化物歧化酶（SOD）样活性值为461.37 U mg^?1。动力学和紫外-可见光谱分析显示，DO-CDs能以浓度依赖的方式有效清除各种自由基。电子自旋共振（ESR）光谱进一步验证了DO-CDs对·O_{2?和·OH自由基的浓度依赖性清除作用。这些发现共同证明DO-CDs具有强大的抗氧化能力，表明其在治疗与过量活性氧产生相关的结肠炎疾病方面具有潜力。}

DO-CDs的细胞抗氧化和抗炎特性

在RAW264.7巨噬细胞中评估了DO-CDs的细胞抗氧化和抗炎功效。用Cy5.5标记的DO-CDs（DO-CDs-Cy5.5）进行细胞摄取实验，显示其在6小时内摄取率可达92.7%。亚细胞定位显示DO-CDs与线粒体的皮尔逊相关系数为0.96，与溶酶体的系数为0.64，表明DO-CDs既具有主动的线粒体靶向能力，又具有溶酶体逃逸特性。使用DCFH-DA和DHE探针检测细胞内活性氧水平，发现DO-CDs能显著降低H₂2O₂诱导的活性氧水平。JC-1染色表明DO-CDs能部分恢复H₂O₂引起的线粒体膜电位（MMP）崩溃。此外，DO-CDs处理减少了脂多糖（LPS）诱导的M1型巨噬细胞（CD86⁺）比例，并促进了M2型巨噬细胞（CD206⁺）的转化。qPCR分析显示，DO-CDs显著下调了LPS诱导的促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β在RNA水平的表达。与铁皮石斛提取物（DO提取物）相比，DO-CDs表现出更优异的体外抗氧化和抗炎能力。DO-CDs共孵育可减轻H₂O₂诱导的细胞死亡，证实其能够抵抗氧化损伤。

DO-CDs的生物学机制

通过对LPS刺激的巨噬细胞进行转录组测序分析，探讨DO-CDs发挥抗炎和抗氧化作用的机制。主成分分析（PCA）显示三组（Control、LPS、LPS+DO-CDs）之间存在显著特征差异。与LPS组相比，DO-CDs上调了269个基因，下调了261个基因。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明，DO-CDs可能通过PI3K-Akt、IL-17和NF-κB等信号通路缓解LPS诱导的细胞损伤。通过维恩图筛选出在Control组和LPS+DO-CDs组中相对于LPS组持续上调或下调的差异表达基因，发现DO-CDs主要通过TNF-NF-κB信号通路发挥作用。其中，Tnfrsf1b（肿瘤坏死因子受体超家族成员1B）是转录组测序中差异表达最显著的基因，它主要通过非经典NF-κB通路介导促炎作用。DO-CDs可能通过下调Tnfrsf1b的表达，干扰非经典NF-κB通路的上游激活节点，从而抑制两条通路的协同激活，最终实现系统性降低炎症水平。

DO-CDs的体内生物分布

为了阐明DO-CDs在体内的分布特征和代谢模式，将DO-CDs与Cy5.5共价连接作为近红外荧光探针（DO-CDs-Cy5.5）。对健康小鼠和溃疡性结肠炎（UC）模型小鼠进行腹腔注射后，在不同时间点（注射后10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和12小时）进行近红外（NIR）活体成像。实验结果显示，DO-CDs-Cy5.5能通过肠系膜上静脉快速吸收，并特异性积聚在结肠组织中。活体成像显示腹部荧光强度在注射后10分钟达到峰值，随后呈指数衰减，12小时后信号显著减弱，表明其代谢半衰期短，在12小时内几乎完全清除。离体器官成像显示，肝脏和肾脏的荧光强度显著高于其他组织，表明肾脏在DO-CDs排泄中占主导地位。比较分析发现，UC模型小鼠的荧光强度明显高于健康小鼠。

DO-CDs对急性结肠炎的治疗效果

通过给小鼠饮用2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液连续7天建立急性结肠炎模型。成功建模后，进行为期4天的治疗干预，每天监测体重变化、粪便特征和疾病活动指数（DAI）。将小鼠随机分为五组：Control组、DSS组、DSS+5-ASA组、DSS+DO组和DSS+DO-CDs组。组织收集显示，药物治疗干预诱导了体重恢复，其中DSS+DO-CDs组恢复最为明显。同时，DSS+DO-CDs组的DAI评分呈同步下降趋势。结肠长度测量显示，DSS+DO-CDs组与DSS组之间存在统计学显著差异，表明DO-CDs恢复了结肠长度。内镜评估显示，DSS对照组有明显的炎症和出血性病变，而治疗组血管清晰度改善，出血减少。苏木精-伊红（H&E）和阿利新蓝（Alcian blue）染色组织病理学分析显示，DSS处理的结肠出现严重的炎症细胞浸润、隐窝结构破坏和杯状细胞耗竭。治疗组则显示出恢复的肠道屏障完整性。DO-CDs治疗显著降低了结肠组织中的丙二醛（MDA）水平，表明有效减轻了氧化应激。qPCR分析进一步证明DO-CDs介导了下调结肠组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。这些发现证实DO-CDs通过氧化应激抑制和炎性细胞因子调节的双重机制，有效恢复肠道屏障功能并改善急性结肠炎进展。

DO-CDs对慢性结肠炎的治疗效果

为了更好地模拟病理进展，建立了慢性结肠炎小鼠模型。数据显示，小鼠在DSS喂养阶段体重显著减轻。虽然在恢复期体重有部分恢复，但由于结肠炎复发，DSS组在第二轮DSS建模后体重恢复明显受阻。相比之下，DSS+DO-CDs组表现出更优的体重恢复。结肠形态学显示，与DSS组相比，DSS+DO-CDs组的结肠长度统计学上显著增加。内镜检查显示DSS组因慢性复发性损伤出现严重的肠壁出血、组织脆性和弹性丧失，而DO-CDs治疗有效减轻了肠道出血。H&E和阿利新蓝染色表明，DSS+DO-CDs组比DSS组具有更完整的隐窝结构和更高的黏蛋白含量，表明黏膜屏障得到修复。

肠道紧密连接蛋白是肠上皮屏障的关键组成部分。免疫荧光染色和Western blot分析显示，DO-CDs治疗后，Occludin、ZO-1和Claudin-1的表达显著上调，表明结肠的上皮屏障得到有效修复。由于M1巨噬细胞的过度活化与肠壁免疫细胞浸润、隐窝脓肿形成和黏膜屏障损伤密切相关，DSS+DO-CDs组中CD86标记的M1巨噬细胞显著减少，表明DO-CDs对结肠炎引起的物理屏障损伤具有良好的修复作用。髓过氧化物酶（MPO）是中性粒细胞活化的标志酶，其活性与炎症部位中性粒细胞浸润呈正相关。DSS+DO-CDs组MPO水平降低，表明中性粒细胞迁移减少，局部炎症减轻。MDA是脂质过氧化的终产物，反映自由基对生物膜的氧化损伤，DSS+DO-CDs组结肠中MDA水平降低，表明氧化应激状态得到改善。qPCR数据证实，DO-CDs显著下调了促炎细胞因子iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-α的表达。这些发现表明DO-CDs治疗能有效重建慢性结肠炎的黏膜和上皮屏障完整性。

DO-CDs对肠道免疫屏障的影响

肠道免疫屏障是抵御病原体入侵的关键防线，在结肠炎发病机制中起核心作用。它由先天免疫系统和适应性免疫系统组成，通过协调机制运作：先天免疫依赖于中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的快速反应，而适应性免疫则在树突状细胞介导的抗原呈递后通过T细胞亚群调节免疫反应。这些系统之间的动态平衡是肠道免疫稳态的基础。

为了研究DO-CDs在慢性结肠炎中的免疫调节机制，在第三次DSS循环结束后立即收集结肠免疫细胞。流式细胞术分析显示，DSS组和DSS+DO-CDs组之间固有层中性粒细胞比例无显著差异。然而，观察到DO-CDs治疗后单核细胞比例显著降低。单核细胞可分化为巨噬细胞和树突状细胞，其减少表明DO-CDs有效抑制了免疫反应。虽然DSS+DO-CDs组的巨噬细胞比例未达到统计学显著性，但呈下降趋势，其中促炎性M1巨噬细胞和树突状细胞与DSS组相比显著减少。这些结果表明，DO-CDs可能在先天免疫水平上通过调节巨噬细胞极化来中断炎症级联反应，并抑制树突状细胞的过度活化，从而减少抗原呈递，抑制异常的T细胞活化，并进一步抑制后续的适应性免疫改变。

适应性免疫在树突状细胞（DCs）抗原呈递后被激活。我们使用流式细胞术评估了肠系膜淋巴结中Th1和Treg细胞的比例。Th1细胞主要通过分泌以IFN-γ和TNF-α为主的促炎细胞因子来维持慢性肠道炎症。相反，Treg细胞是结肠炎中肠道免疫稳态的核心调节者；它们的缺乏直接导致免疫耐受失衡和黏膜屏障损伤。统计学结果显示，与DSS组相比，DSS+DO-CDs组Th1细胞比例显著降低，Treg细胞数量增加，并且Treg/Th1比率恢复到Control组水平。这些发现表明，DO-CDs通过双向调节Th1/Treg细胞的动态平衡，逆转了巨噬细胞向促炎M1表型极化、加剧肠黏膜炎症浸润以及过度Th1细胞活化引起的氧化损伤等病理过程。这证实了DO-CDs纠正免疫失调的治疗能力，并为其在慢性结肠炎黏膜屏障修复中的作用提供了直接的免疫学证据。重要的是，Th1/Treg平衡的恢复不仅中断了"Th1细胞活化-M1巨噬细胞极化-炎症放大"的正反馈循环，还通过恢复Treg细胞的免疫抑制功能，协同促进抗炎微环境的形成和肠上皮的修复。这突显了DO-CDs免疫调节和屏障修复效应之间的协同机制。

DO-CDs的生物相容性

生物相容性是纳米材料发挥生物功能的基础。为了评估DO-CDs对各种组织和器官的潜在毒性，我们在细胞和动物水平上评估了DO-CDs的生物相容性。通过活/死细胞染色实验验证了DO-CDs的细胞毒性。流式细胞术显示，RAW264.7细胞与200 μg mL^?1 DO-CDs孵育24小时后，活细胞比例为96.6%。MTT实验证实了体外生物安全性，RAW264.7和CT26细胞在200 μg mL^?1 DO-CDs中暴露24小时和48小时后，细胞活力均大于80%。

在动物水平上，通过每天腹腔注射20 mg kg^?1 DO-CDs，连续7天，评估全身生物相容性。溶血相容性测试显示，红细胞与1 mg mL^?1 DO-CDs在37°C孵育4小时后，溶血率仅为4.78%。H&E染色组织病理学评估证实，DO-CDs处理的小鼠未观察到器官损伤。血常规参数和器官功能生物标志物的比较分析显示，组间无统计学显著差异。此外，治疗后血液检测数据表明，DO-CDs在有效治疗急性结肠炎的同时，可以改善炎症引起的血液指标异常和代谢紊乱，且未对肝、肾等重要器官造成急性损伤。这些数据共同证明了DO-CDs良好的生物相容性。

结论

本研究通过体内外模型，系统评估了DO-CDs通过清除活性氧、调节炎症和恢复肠道屏障的治疗潜力。在DSS诱导的慢性结肠炎模型中，DO-CDs有效降低了M1巨噬细胞比例，抑制了树突状细胞活化，恢复了Th1/Treg细胞平衡，并下调了促炎细胞因子的表达。由于炎症细胞浸润减少，结肠上皮细胞间紧密连接蛋白表达增加，促进了肠道机械屏障的修复。同时，杯状细胞分泌的黏蛋白在上皮屏障上形成了保护性黏液层。恢复的黏膜屏障有效隔离和控制了微生物的定植和入侵。这些结果表明，DO-CDs通过重塑黏液-机械-免疫屏障三联体来缓解结肠炎进展，从而为天然产物衍生碳点的生物医学应用提供了理论基础和技术参考。未来的研究应侧重于阐明长期毒性、优化药代动力学特征以及开发靶向递送策略，以推进其用于炎症性疾病治疗的临床转化。