USP30通过调控S-腺苷甲硫氨酸循环破坏内皮细胞功能并加重急性肺损伤的作用与机制研究

《Advanced Science》：Activation of USP30 Disrupts Endothelial Cell Function and Aggravates Acute Lung Injury Through Regulating the S-Adenosylmethionine Cycle

本研究首次揭示了去泛素化酶USP30在急性肺损伤（ALI）中的关键作用。文章阐明了脂多糖（LPS）激活USP30，进而通过去泛素化稳定甲硫氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A），维持S-腺苷甲硫氨酸（SAM）循环和全局DNA甲基化水平，从而抑制miR-30a-5p的表达。抑制USP30则通过破坏这一通路，上调miR-30a-5p，进而抑制其下游靶点MDM2和NFAT5，最终减轻内皮细胞（EC）炎症反应和屏障功能障碍。研究利用内皮细胞特异性USP30基因敲除（EC-USP30KO）小鼠模型，在多种ALI模型（内毒素诱导、缺血再灌注）中验证了靶向USP30的治疗潜力，为急性炎症性疾病的治疗提供了新的潜在策略。

　　

摘要

微血管功能障碍是急性炎症性疾病发展的关键因素，其特征是血管通透性增高和白细胞浸润到间质组织中。本研究首次确定USP30是肺微血管炎症和内皮细胞屏障完整性的关键调节因子。LPS诱导USP30的去泛素酶活性。研究证明USP30的激活会加剧内皮细胞功能障碍，而抑制USP30可使内皮细胞的炎症反应减弱50%。在体内实验中，内皮细胞特异性USP30缺陷小鼠在内毒素诱导和缺血再灌注肺损伤模型中表现出减轻的微血管功能障碍。USP30的抑制通过一种不依赖于线粒体自噬的机制保护内皮细胞功能，该机制涉及S-腺苷甲硫氨酸循环、DNA甲基化和miR-30a-5p表达。从机制上讲，USP30耗竭通过去泛素化作用 destabilizes 并减少甲硫氨酸腺苷转移酶2A，这反过来使SAM水平降低约40%，并使全局DNA甲基化降低约35%，从而导致miR-30a-5p上调四倍。升高的miR-30a-5p抑制MDM2和NFAT5的表达，有助于维持内皮细胞功能。这些发现强调，靶向USP30可能代表一种值得在急性肺损伤中进行进一步临床前和临床探索的潜在治疗策略。

1 引言

微血管炎症和屏障破坏在急性炎症性疾病的发病机制中起关键作用，包括铜绿假单胞菌或SARS-CoV-2诱导的急性呼吸窘迫综合征和脓毒症。响应炎症刺激，如细菌内毒素，内皮细胞增加趋化因子和粘附分子的表达，最终导致中性粒细胞募集和迁移、内皮屏障破坏以及随后的肺组织损伤。因此，保护内皮细胞功能是治疗急性炎症性疾病的一种有前景的策略。

去泛素化酶通过从泛素化蛋白质中去除单泛素或多泛素链来调节蛋白质的稳定性和活性。USP30是一种位于线粒体外膜的去泛素化酶，以其在细胞应激下对抗Parkin和Pink1介导的线粒体自噬的经典作用而闻名。线粒体自噬在内皮细胞功能中扮演着不同的角色。本研究旨在探讨USP30在维持微血管完整性中的作用。

S-腺苷甲硫氨酸是DNA甲基化的关键甲基供体，由甲硫氨酸通过甲硫氨酸腺苷转移酶合成。DNA甲基化是抑制基因表达的主要表观遗传机制，包括microRNAs的表达。MiR-30a-5p已被证实与调节内皮-间质转化、细胞增殖和内皮细胞衰老有关，并能保护内皮细胞免受缺氧诱导的细胞凋亡。此外，外源性miR-30a-5p通过减弱LPS诱导的神经胶质细胞和A549细胞的炎症反应，显示出抗炎特性。然而，miR-30a-5p在内皮细胞炎症和屏障功能中的作用及其在内皮细胞中的调控机制尚不清楚。

2 结果

2.1 LPS增加USP30活性

USP30是一种线粒体外膜去泛素化酶，在神经退行性疾病和癌症中已有研究，但其在内皮功能中的作用尚未探索。对肺单细胞RNA-seq数据的重新分析显示，USP30在所有内皮细胞亚型中普遍表达。为了评估其在急性炎症中的相关性，研究人员检测了LPS刺激后的USP30活性。在过表达TLR4/CD14并转染了V5标记的USP30的HEK293细胞中，LPS处理显著增加了USP30的去泛素酶活性。与USP30对K6连接的多泛素链的特异性一致，USP30的过表达减少了K6连接的多泛素化，而这种效应在LPS处理后增强，表明炎症刺激增强了USP30的去泛素酶活性。

2.2 USP30抑制减弱内皮炎症和屏障功能障碍

鉴于内皮细胞炎症和屏障功能障碍在急性炎症性疾病中的核心作用，研究人员探讨了USP30是否调节这些过程。VCAM1和ICAM1的上调是发炎内皮细胞的特征。LPS和TNFα处理均上调了人肺微血管细胞中VCAM1和ICAM1的表达，而下调USP30或用MF-094进行药理学抑制则显著抑制了这种上调，表明USP30在炎症条件下被激活，并在内皮细胞中发挥促炎作用。

保持微血管屏障完整性对于维持组织稳态至关重要。接下来，研究人员通过Trans-well通透性实验和电子细胞基质阻抗传感系统测定了USP30敲低对LPS诱导的内皮细胞高通透性的影响。LPS增加了FITC标记的葡聚糖渗漏并降低了跨内皮电阻，表明LPS诱导了内皮细胞高通透性。USP30下调的细胞在这两种实验中均减弱了LPS的有害效应，表明抑制USP30可防止LPS诱导的内皮细胞高通透性。此外，USP30敲低增加了人肺微血管细胞的迁移、增殖和粘附。这些数据共同揭示，抑制USP30可在炎症应激下保护内皮细胞功能。

2.3 内皮细胞特异性USP30基因敲除小鼠免受急性肺损伤

为了在体内验证这些发现，研究人员构建了内皮细胞特异性USP30缺陷小鼠。通过PCR、免疫印迹和免疫荧光确认了成功的基因敲除。从EC-USP30KO小鼠分离的内皮细胞对LPS诱导的内皮屏障破坏表现出抵抗性。

研究人员利用三种急性肺损伤小鼠模型来研究内皮细胞中USP30的缺失是否能减轻微血管功能障碍和急性肺损伤的严重程度。气管内滴注LPS模拟了细菌感染诱导的急性肺损伤，它直接靶向肺部；腹腔注射LPS是模拟脓毒症诱导急性肺损伤的成熟模型；肺缺血再灌注损伤有效模拟了与肺移植、体外膜肺氧合、肺栓塞和心脏骤停相关的急性肺损伤。

气管内滴注LPS增加了野生型小鼠的支气管肺泡灌洗液蛋白水平、IL-6、IL-1β和中性粒细胞流入，但这些效应在EC-USP30KO小鼠中均减弱。此外，H&E染色显示，与野生型小鼠相比，EC-USP30KO小鼠显示出减少的炎症细胞浸润。通过伊文思蓝体内渗漏实验和肺湿/干重比评估肺血管通透性。EC-USP30KO小鼠减少了LPS攻击诱导的肺内伊文思蓝积聚和肺湿/干重比。

除了直接的肺损伤模型，还使用了系统性内毒素诱导的肺损伤模型和肺缺血再灌注损伤模型。内皮细胞USP30缺失减少了腹腔注射LPS后伊文思蓝向肺组织的渗漏、支气管肺泡灌洗液IL-1β、支气管肺泡灌洗液IL-6、血浆IL-1β和血浆IL-6。此外，肺缺血再灌注增加了野生型小鼠左肺的支气管肺泡灌洗液蛋白浓度、IL-6、KC、中性粒细胞流入、湿/干重比和伊文思蓝向间质组织的渗漏，而内皮细胞USP30的缺失改善了肺缺血再灌注诱导的肺部炎症和水肿。左肺H&E染色提示内皮细胞USP30缺失降低了肺损伤的严重程度。一致的体内和体外数据表明，抑制USP30可保护内皮细胞功能并减轻肺损伤。

2.4 USP30敲低上调miR-30a-5p

为了进一步探索USP30抑制减少内皮细胞炎症和保持内皮细胞屏障完整性的机制，研究人员检查了与内皮细胞炎症和屏障功能相关的通路，包括NF-κB和p38 MAPK的磷酸化。在响应LPS或TNFα时，未观察到USP30敲低细胞与对照细胞相比有改变。

越来越多的证据表明microRNAs调节血管发育、生长、炎症反应和屏障完整性，但尚无研究证明USP30在调节microRNA表达中的作用。研究人员进行了非偏向性的microRNA测序，发现敲低USP30调节了多种microRNAs的表达。MiR-30a-5p是USP30敲低的人肺微血管细胞中上调最显著的microRNAs之一，这一点通过实时PCR得到了证实。

为了进一步研究抑制USP30增加miR-30a-5p的机制，研究人员调查了USP30敲低对线粒体功能的影响。线粒体超氧化物产生和线粒体自噬标志物未因USP30敲低而显著改变。研究人员之前已证明抑制USP30可增加HeLa细胞中的ATP产生。此外，他们发现敲低USP30也增加了人肺微血管细胞中的线粒体呼吸和ATP产生，支持内皮USP30调节线粒体功能，但至少在急性期，不调节线粒体来源的活性氧产生和线粒体自噬。USP30缺失后ATP的增加似乎不是miR-30a-5p上调的主要机制。因此，需要进一步研究USP30抑制增加miR-30a-5p水平的非经典机制。

2.5 USP30通过SAM代谢和DNA甲基化调节miR-30a-5p

细胞代谢在转录过程的表观遗传调控中发挥作用。USP30在细胞代谢中的作用尚不清楚。研究人员通过LC-MS分析了USP30 siRNA转染的人肺微血管细胞中的细胞代谢变化。偏最小二乘判别分析显示siControl组和siUSP30组之间存在明显分离。观察到多种细胞代谢物的剧烈变化，包括磷酸戊糖途径、嘌呤代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等。

SAM是DNA甲基化的主要细胞甲基供体。研究人员发现，在USP30 siRNA转染的人肺微血管细胞中，SAM水平降低。这伴随着全局DNA甲基化的降低。此外，与之前的报道一致，用5-氮杂胞苷抑制DNA甲基化增加了miR-30a-5p的表达。甲硫氨酸腺苷转移酶负责从甲硫氨酸生物合成SAM。补充SAM降低了miR-30a-5p水平，表明DNA甲基化抑制miR-30a-5p表达。此外，用PF9366抑制MAT2A增加了miR-30a-5p；相反，过表达MAT2A降低了miR-30a-5p。在USP30缺陷细胞中升高的miR-30a-5p可通过过表达MAT2A来减弱。这些结果将USP30与通过SAM循环进行的表观遗传调控联系起来。

2.6 USP30去泛素化并稳定MAT2A

研究人员发现，在MAT的同工型中，MAT2A在USP30 siRNA转染的人肺微血管细胞和从EC-USP30KO小鼠分离的肺内皮细胞中均减少。为了研究抑制USP30降低MAT2A水平的分子机制，他们检测了MAT2A的mRNA水平，发现下调USP30并未改变MAT2A基因转录水平，表明抑制USP30导致的MAT2A减少可能是由于蛋白质降解增加。

迄今为止，尚无研究探讨MAT2A的降解。研究人员发现，MAT2A的降解被溶酶体抑制剂亮抑蛋白酶肽抑制，而不被蛋白酶体抑制剂MG-132抑制。共免疫荧光染色显示MAT2A与溶酶体共定位，表明MAT2A降解是由溶酶体介导的。从机制上讲，敲低USP30缩短了MAT2A的半衰期。共免疫沉淀和共免疫荧光染色证实了MAT2A与USP30相关。此外，下调USP30增加了MAT2A的多泛素化，确立了MAT2A是USP30的一个新底物。

2.7 USP30-miR-30a-5p轴调节MDM2和NFAT5

MiRNA TARGETSCAN软件分析显示，MDM2是小鼠和人类miR-30a-5p的可能靶点，并定位于3‘非翻译区。为了验证miR-30a-5p是否调节MDM2 mRNA表达，研究人员分析了miR-30a-5p模拟物转染的人肺微血管细胞中的MDM2 mRNA水平，发现miR-30a-5p水平增加降低了MDM2 mRNA以及MDM2蛋白水平，而不改变USP30水平。

由于USP30调节miR-30a-5p，研究人员假设USP30调节MDM2表达。结果显示，下调USP30降低了MDM2 mRNA和蛋白表达。用MF-094抑制USP30以剂量依赖的方式降低了MDM2蛋白水平。此外，研究人员发现miR-30a-5p下调了人肺微血管细胞中转录因子NFAT5的表达。下调USP30也相应地降低了NFAT5的表达，表明他们揭示了一个新的调控级联，将USP30/miR-30a-5p/MDM2和NFAT5在微血管内皮细胞中联系起来。

2.8 MiR-30a-5p/MDM2和NFAT5轴介导内皮炎症和屏障完整性

如上所述，USP30调节内皮细胞炎症和屏障功能，并调节miR-30a-5p/MDM2和NFAT5的表达。MDM2和NFAT5已被证明在细胞核中作为NF-κB的共转录因子促进炎症反应。因此，研究人员假设miR-30a-5p/MDM2和NFAT5轴可能调节内皮细胞炎症。

人肺微血管细胞被转染miR-30a-5p模拟物或MDM2 siRNA，或用NFAT5抑制剂处理，随后用LPS或TNFα处理6小时。结果显示，升高miR-30a-5p或下调MDM2减弱了人肺微血管细胞中VCAM1的表达。此外，miR-30a-5p抑制剂促进了LPS诱导的人肺微血管细胞高通透性，表明miR-30a-5p/MDM2轴，作为USP30的下游通路，调节内皮细胞炎症和屏障完整性。抑制NFAT5显著保护了免受LPS诱导的内皮细胞高通透性。KRN5略微减弱了LPS诱导的ICAM1和VCAM1表达，表明miR-30a-5p/NFAT5轴主要调节微血管内皮细胞通透性。这些数据共同揭示了一个潜在的级联反应：抑制USP30 ? 降低SAM循环 ? 增加miR-30a-5p ? 降低MDM2和NFAT5水平 ? 保护内皮细胞功能。

3 讨论

微血管过度炎症和屏障破坏是急性炎症性疾病的核心特征，导致炎症细胞浸润、组织水肿，并最终导致器官功能障碍。虽然之前的研究表明抑制USP30可诱导心肌细胞中的线粒体自噬，但其在微血管功能调节中的作用尚不清楚。本研究首次提供了证据，表明USP30在内毒素暴露时被激活，抑制USP30可保护肺微血管内皮细胞免受炎症刺激和实验性肺损伤。

从机制上讲，USP30敲低促进了MAT2A的降解，MAT2A是甲基供体合成中的关键酶，导致DNA甲基化减少和miR-30a-5p表达增加。此外，研究显示miR-30a-5p下调MDM2和NFAT5，这两个是损害内皮细胞屏障功能的促炎介质。这些发现揭示了USP30在调节内皮炎症和通透性方面的一个新的、不依赖于线粒体自噬的作用。

USP30是一种线粒体去泛素化酶，可从线粒体外膜蛋白上移除多聚泛素链。过表达USP30减少线粒体自噬并促进细胞凋亡。然而，USP30在内皮细胞和炎症性肺病中的作用尚未见报道。本研究显示USP30的活性在响应LPS时增加。有研究表明USP30可被IKKβ磷酸化并激活，而IKKβ是LPS/TLR4信号通路的关键下游分子。IKKβ的激活调节内皮细胞炎症反应。IKKβ在LPS诱导的USP30磷酸化和激活中的作用需要在内皮细胞中进行未来研究。本研究重点在于USP30在微血管内皮细胞炎症和单层通透性中的作用。数据揭示抑制USP30通过阻碍内皮细胞炎症反应和高通透性来保护内皮细胞完整性。使用三种不同的急性肺损伤小鼠模型，证明内皮细胞特异性USP30基因敲除显著减少血管渗漏、细胞因子产生和肺部炎症。

虽然大多数关于USP30的研究集中在其在线粒体自噬中的作用，但本研究数据表明其对内皮细胞功能的影响是通过一种新的表观遗传机制介导的。USP30缺陷仅适度调节线粒体呼吸、活性氧产生和线粒体自噬标志物的变化。相反，研究人员观察到USP30缺陷的内皮细胞中miR-30a-5p显著上调。MiR-30a-5p已被证明可改善LPS诱导的A549细胞和小胶质细胞的炎症反应。进一步，研究人员确定MDM2和NFAT5是miR-30a-5p的下游靶点，并证明抑制它们可减轻LPS诱导的内皮细胞炎症和高通透性。据所知，这是首次揭示NFAT5在内皮细胞高通透性中的作用的研究。

研究人员进一步揭示了USP30与DNA甲基化之间的机制联系。MiR-30a-5p启动子区DNA甲基化增加与miR-30a-5p抑制相关。本研究显示，抑制DNA甲基化增加了肺内皮细胞中miR-30a-5p的表达。进一步，研究人员揭示了一个未被发现的机制，即抑制USP30促进MAT2A的泛素化和降解，导致甲基供体水平和DNA甲基化降低。这引发了一条通过SAM循环连接线粒体和核DNA甲基化的分子通路。MAT2A是SAM生产的关键酶；然而，MAT2A稳定性的分子调控仍属未知。本研究显示MAT2A降解由泛素化介导，而USP30负调控MAT2A的泛素化。未来关于MAT2A稳定性的研究可能集中于识别靶向MAT2A的泛素E3连接酶。USP30/MAT2A/DNA甲基化轴是USP30的一个未被揭示的非经典功能。

总之，本研究通过一个先前未被认识的涉及MATA2A降解、DNA甲基化和miR-30a-5p表达的表观遗传机制，确定了USP30作为内皮炎症和屏障功能的新调节因子。这些发现不仅扩展了我们对血管生物学中线粒体-核通讯的理解，而且强调靶向USP30可能代表一种值得在急性炎症性疾病中进行进一步临床前和临床探索的潜在治疗策略。