白细胞介素6基因在气道上皮细胞中的免疫训练是哮喘急性发作的核心机制

《Allergy》：Immune Training of the Interleukin 6 Gene in Airway Epithelial Cells is Central to Asthma Exacerbations

本文揭示了呼吸道病毒通过诱导气道上皮细胞中白细胞介素6（IL-6）基因的低甲基化（IL6M），驱动IL-6过度释放和IL-6反式信号（IL6TS）激活，从而导致哮喘急性发作的关键机制。研究结合动物模型、体外细胞实验和人类队列数据，证实靶向IL-6通路可有效抑制哮喘恶化，为识别易急性发作患者提供了新的生物标志和治疗策略。

　　

ABSTRACT

呼吸道病毒感染是诱发哮喘急性发作的主要因素，临床研究提示白细胞介素6（IL-6）释放增加可能参与这一过程。本研究旨在阐明IL-6在哮喘急性发作中的病理生理作用及其释放增强的机制。

材料与方法

研究采用野生型与IL-6基因敲除（IL-6^?/?）小鼠，通过鼻腔应用poly(I:C) 诱导卵清蛋白（OVA）致敏的过敏性哮喘急性发作模型。检测指标包括气道炎症、细胞因子表达与释放、黏液生成及气道高反应性。使用鼻腔给予抗IL-6抗体进行中和实验。在人支气管上皮细胞系BEAS-2B中，用poly(I:C)刺激或人鼻病毒16（RV16）感染，并量化IL6基因表达与DNA甲基化水平。此外，在成人哮喘患者（队列I，n = 54）的气道上皮细胞和All-Age-Asthma cohort（ALLIANCE）的儿童及成人鼻上皮细胞（分别n = 53和n = 108）中进行了全基因组DNA甲基化分析。

结果

在小鼠模型中，poly(I:C)诱导的哮喘急性发作之前和伴随气道上皮中IL-6的过度释放，而IL-6中和完全阻止了急性发作的发生。在人呼吸上皮细胞中，重复RV16或poly(I:C)感染/刺激训练了IL-6的释放。在患者中，IL6基因低甲基化与高IL6表达及未来急性发作风险增加相关。

结论

过度IL-6释放是实验性哮喘急性发作的必要条件，可能是病毒PAMP诱导气道上皮细胞免疫训练的结果。此外，携带训练性IL-6反应表观遗传特征（即IL6基因低甲基化）的哮喘患者急性发作更频繁。这些发现为识别和治疗易急性发作患者开辟了新途径。

图形摘要

本研究旨在探讨免疫激活如何影响哮喘急性发作期间白细胞介素6（IL-6）基因的表观遗传调控和表达。通过研究免疫训练的分子机制，我们试图阐明IL-6驱动的炎症通路如何导致气道功能障碍和哮喘症状恶化。我们采用多层次转化研究流程，在实验性哮喘急性发作小鼠模型、体外组织培养模型和人类队列中确定了IL-6的作用、其基因甲基化及下游信号传导。小鼠模型通过使用IL6敲除动物和应用中和抗体的模拟治疗手段，共同印证了IL-6表达的核心作用。组织培养模型使用了支气管上皮细胞系（BEAS-2B）以及原代鼻和支气管上皮细胞。在BEAS-2B细胞中，重复病毒感染或poly(I:C)刺激导致IL-6释放增加并观察到表观遗传训练。原代上皮细胞用于确认DNA甲基化（DNAm）对IL-6转录和分泌的影响。人类队列用于建立哮喘患者中DNAm、IL-6表达和IL-6反式信号（IL6TS）之间的分子互相关。鼻和支气管标本证明了DNAm和IL6TS在上、下气道之间互相关的可转移性。鼻标本数据用于关联临床结局（急性发作），以验证小鼠模型发现。在儿科队列中，36个月的随访设计允许首次与疾病轨迹结局进行关联。本研究揭示了免疫激活如何影响哮喘急性发作期间IL-6基因的表观遗传调控和表达。Poly(I:C)诱导的过度IL-6释放，由呼吸上皮先天免疫训练驱动，是实验性哮喘急性发作所必需的。重复RV16或poly(I:C)暴露训练了人呼吸上皮细胞的IL-6释放。携带训练性IL-6反应（以IL6基因低甲基化为特征）的哮喘患者急性发作更频繁。

缩写

ALLIANCE: All-age asthma cohort（全年龄段哮喘队列）

BALF: bronchoalveolar lavage fluid（支气管肺泡灌洗液）

IL: interleukin（白细胞介素）

IL6TS: IL-6 trans-signalling（IL-6反式信号）

OVA: ovalbumin（卵清蛋白）

Poly(I:C): polyinosinic: polycytidylic acid（聚肌胞:聚胞苷酸）

RV16: rhinovirus-16（人鼻病毒16型）

1 引言

哮喘急性发作见于所有哮喘表型，但在严重或难治性哮喘患者中尤为常见，尽管加强了治疗，仍导致医疗资源使用增加。急性发作最常见的原因是呼吸道病毒感染，如人鼻病毒（RV）、呼吸道合胞病毒和冠状病毒。尽管这些病毒可引发许多哮喘患者的症状，但为何仅部分患者经历频繁急性发作仍不清楚。宿主防御机制，包括上皮释放警报素白细胞介素（IL）25、趋化因子、I/III型干扰素以及内质网驻留适配蛋白干扰素基因刺激因子（STING）或视黄酸诱导基因I（RIG-I）炎症小体的激活，已被报道可促进哮喘症状恶化。最近两项针对哮喘患者的研究提示白细胞介素6（IL-6）参与急性发作的病理机制：第一项研究发现血清IL-6水平高（>1 pg/mL）的患者急性发作风险增加；第二项研究表明支气管IL-6反式信号（IL6TS）高表达谱（提示IL-6释放增加）也与更多急性发作相关。IL-6信号传导通过多种方式进行：经典信号、反式信号和集群信号。与经典和集群IL-6信号不同，IL6TS发生在IL-6与其可溶性受体（sIL-6R）结合时，允许信号通过表达膜结合gp130的细胞进行转导。该机制被认为是IL-6促进（慢性）炎症性疾病的主要途径，使其成为治疗干预的关键靶点。尽管IL-6和其他宿主防御机制不一定与反复急性发作相关，但哨兵细胞如支气管上皮细胞（BEC）会记住先前与病原化合物的接触。这种记忆进而改变它们 upon 再感染时的反应，一种被称为“训练免疫”的机制。

对于本研究，我们假设反复呼吸道病毒感染引起的过度IL-6释放是哮喘急性发作发展的核心。

2 材料与方法

2.1 体内动物研究

雌性野生型C57BL/6、IL-6缺陷（IL-6^?/?）和IL-6报告基因（Il6^{tm3307(Cerulean-P2A-CD90.1)Arte}）小鼠（除非另有说明，每组n = 8），年龄6-8周，在无特定病原体条件下饲养。所有动物研究均符合德国动物保护法，并经地方动物研究伦理委员会批准。实验性过敏性哮喘（EAA）及随后的急性发作按先前描述及补充材料中的方法诱导。对于IL-6中和，在第28天通过口咽途径给予抗IL-6单克隆抗体。对于重复poly(I:C)暴露，每周过敏原气溶胶攻击持续额外四周，在第35、42、49和57天给予poly(I:C)。对于poly(I:C)剂量实验，小鼠在第28天接受0、2、20或200 μg poly(I:C)。动力学实验在最后一次poly(I:C)应用后2、4、8和12小时采样；所有其他实验在24小时采样。阴性对照用磷酸盐缓冲盐水（PBS）假致敏，随后用OVA气溶胶攻击并用PBS处理。

2.2 人支气管上皮细胞的体外研究

人支气管上皮细胞系BEAS-2B (CRL-9609) 购自ATCC。细胞然后按先前描述感染人鼻病毒16（RV16）。来自五名哮喘供体的原代病变人支气管上皮细胞（DHBE）在体外用poly(I:C)和重组人IL-13刺激。

2.3 离体研究

2.3.1 队列I：气道上皮细胞

气道上皮细胞（AEC）样本来源于先前研究中招募的54名哮喘受试者。在芝加哥大学进行支气管镜检查期间收集支气管内刷检物。哮喘受试者的纳入基于当前医生的哮喘诊断，并且没有并存的肺部疾病。所有患者在采样时均在使用处方哮喘药物。支气管刷检按先前描述进行。队列I的临床特征见表S2。该先前描述队列的DNA甲基化、转录组和临床数据用于本研究的分析。这些研究经芝加哥大学IRB协议#09–421-B和#15361A批准。

2.3.2 ALLIANCE队列：儿科和成人组

All-Age-Asthma（ALLIANCE）儿科队列的纳入标准包括年龄6-18岁、足月分娩（≥37周）、主动/被动理解德语、并且有医生根据当前GINA指南诊断的哮喘（年龄≥6岁）。纳入了90名儿科参与者的鼻刷样本，这些样本有足够的DNA，其中53名患者有3年随访数据（图S1）。儿科队列的人口学特征见表1。

成人ALLIANCE队列包括年龄≥18岁、主动/被动理解德语的个体。成人健康对照为无任何现有肺部疾病的个体。纳入了182名成人参与者的鼻刷样本，这些样本有足够的DNA，其中108个样本有足够的RNA回收（图S1）。成人队列的人口学特征见表S3。

ALLIANCE研究方案经吕贝克大学地方医学伦理委员会批准（投票12–215；18.12.2012），所有患者或其父母/监护人均签署书面知情同意书。ALLIANCE研究儿科和成人组的完整纳入/排除标准先前已描述。

2.4 原代鼻上皮细胞离体感染人鼻病毒16

从我们的体内鼻刷收集中筛选鼻DNA甲基化数据。来自ALLIANCE儿科队列儿童（n = 34为低IL6基因位点DNA甲基化，n = 19为高甲基化）的鼻上皮细胞样本在预涂牛源性胶原蛋白1（C5533, Sigma-Aldrich, Germany）的六孔板上培养。细胞用人鼻病毒16（HRV）以感染复数（MOI）为10感染48小时，37°C，如先前描述。作为对照，细胞用病毒缓冲液处理，并指定为MOCK样本。

使用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) 从MOCK和HRV感染（+HRV）的原代鼻上皮细胞中分离RNA。使用Agilent RNA 6000 Nano Chip Kit (Agilent, Santa Clara, USA) 定量RNA浓度和质量。选择RNA完整性数字（RIN）分数大于8的样本进行进一步分析。在基尔基督教-阿尔布雷希特大学临床分子生物学研究所进行了配对末端RNA测序。去除rRNA，并使用TruSeq stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, USA) 生成文库，通过NovaSeq 6000 System S4 (Illumina, San Diego, USA) 处理，读长为2 × 100 bp。每个样本获得约2500万条读段。

然后根据受试者的IL6TS谱进行分层，并分析与IL-6浓度（ng/ml）的关联。

2.5 全基因组微阵列、DNA甲基化和RNA表达分析

使用SurePrint G3 Human Gene Expression 8 × 60K Microarray进行全基因组转录组分析，数据通过全局中位数转换和log2倍数变化计算进行标准化。使用亚硫酸氢盐转化的DNA和HumanMethylation450 Bead Chip kit进行DNA甲基化分析，β值使用Illumina算法标准化。使用HiSeq2500 System进行RNA测序，读段使用GSNAP比对，数据以每千碱基每百万映射读段（RPKM）表示。质量控制包括转录组数据的主成分分析（PCA）以及从进一步分析中排除受损的微阵列信号。

3 统计分析

使用单因素方差分析（one-way ANOVA）及随后的Tukey检验确定差异显著性。使用JMP 13 (SAS, USA) 分析表达和DNA甲基化数据。在适当情况下应用多重检验校正。

使用Shapiro–Wilk检验评估数据分布的正态性。对于少于30个观测值或不服从正态分布的数据集，应用非参数检验（Wilcoxon符号秩检验、Mann–Whitney U检验）。所有统计分析均使用GraphPad Prism (Version 10) 进行。

根据JMP 13中实现的Ward方法进行层次聚类。统计学显著差异定义为p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001, p < 0.0001，n.s. = 不显著。使用‘R’软件（v4.3.0）和circlize包（v0.4.15）生成IL-6反式信号（IL6TS）的环形图表示。IL6 DNA甲基化beta值按探针进行特征缩放，遵循均值标准化方法。IL6基因DNA甲基化、IL-6蛋白生产和IL6TS基因签名以患者特异性方式对齐。

4 结果

4.1 小鼠实验性哮喘的急性发作与夸张的IL-6释放相关

局部应用poly(I:C)（病毒PAMP（模式相关分子模式）dsRNA的成熟替代物）诱导了EAA的急性发作，其特征是气道炎症加重、气道高反应性（AHR）和黏液产生（图1A–D）。尽管EAA本身已与支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-6水平升高相关，但发生EAA急性发作的动物显示BALF中IL-6水平高达四倍，血清水平超过20倍（图1E,F），肺组织中IL6表达高达15倍（图1G），而可溶性IL-6受体（sIL-6R）的释放保持不变（图1H,I）。在先前与过敏性炎症或抗病毒免疫反应相关的15种分析介质中（图S2A–P），IL-6在所有时间点释放浓度最高，达到可识别峰值最早，并且与稳定疾病相比显示出最大的反应（图1J）。

4.2 小鼠实验性哮喘的急性发作需要夸张的IL-6释放

相应地，在临床研究中，我们的动物模型显示急性发作与IL-6增加之间存在关联。因此，我们接下来在IL-6^?/?动物中评估了IL-6的功能相关性。这些小鼠是健康的，并表现出EAA的病理生理特征，但与野生型动物相反，暴露于poly(I:C)并未导致气道炎症、AHR或黏液产生的恶化，因此没有发生急性发作（图2A–D）。此外，致敏的IL-6^?/?小鼠在OVA攻击后显示比野生型动物更高的炎症细胞计数和介质水平（例如IL-5和eotaxin）（图S3A–I），因此我们不能排除IL-6对致敏或局部对OVA反应的任何影响。因此，我们随后用抗IL-6抗体预处理正在经历poly(I:C)诱导的EAA急性发作方案的野生型动物。同样，IL-6中和阻止了病理生理特征的恶化和EAA急性发作，并且与用对照抗体处理的动物相比，甚至降低了中性粒细胞数量（图2E–H；图S3J–R），证明了IL-6在小鼠EAA急性发作发展中的关键作用。此外，在患有EAA的小鼠中，局部应用增加剂量的poly(I:C)导致气道中IL-6水平增加，伴随着剂量依赖性的EAA标志恶化和急性发作样特征（图S4A–B）。

4.3 重复RV16感染训练IL-6释放并在体外诱导BECs中的IL6TS高表达谱

临床上，先前的急性发作会增加未来急性发作的风险。因此，我们假设反复暴露于呼吸道病毒会增强随后的IL-6释放，最终可能通过涉及先天免疫训练的机制。

IL-6生产被描述用于多种免疫细胞以及一些结构细胞，这与来自发生急性EAA急性发作的IL-6报告基因小鼠肺部的抗CD90.1免疫组织化学染色一致（图S5A–D）。FACS分析未显示快速反应的先天免疫细胞（如γδ T细胞、NK细胞、NKT细胞或ILC细胞）浸润肺部（图S6A–E）。动力学研究进一步显示，中性粒细胞（另一个假定的IL-6来源）的浸润峰值远晚于BALF中的IL-6水平，并且巨噬细胞数量随时间没有变化（图S7A,B）。因此，我们决定进一步关注气道上皮细胞（AEC），它们（除了内皮细胞）表现出强烈的IL-6报告基因染色（图S5A），并被描述为既是呼吸道病毒的哨兵细胞也是靶细胞。

因此，BEAS-2B细胞在体外用poly(I:C)反复刺激。IL6表达随着暴露次数（NOE）显著增加（图S8A），类似于经历重复poly(I:C)滴注的具有EAA特征的小鼠（图S8B）。因此，为了真实模拟病毒感染，我们随后用RV16反复感染BEAS-2B细胞（图3A）。这导致IL-6释放显著增加（图3B）。我们接下来使用由Jevnikar及其同事开发的基因表达谱来 interrogate IL6TS。该谱由七个基因（CHIL3L1, TNFAIP6, IL1R2, S100A8, S100A9, PDE4B和S100A12）组成（表S4），我们将其（Ward）聚类为高谱与低谱（图3C）。在重复感染（NOI 3–5, RV16）的BEAS-2B培养物中，70%的IL-6释放导致IL6TS高谱。相反，在单次感染实验（NOI 1）中，IL6TS高极少（8%的培养物）（图3D；卡方：p < 0.01）。有趣的是，具有IL6TS高谱的细胞主要显示IL6基因的低甲基化。因此，具有IL6TS低谱的细胞在IL6基因（IL6M）处是高甲基化的（图3E；卡方：p < 0.01和图S9）。因此，反复感染的BEAS-2B中IL-6释放增加与IL6基因的低甲基化和IL6TS高谱均相关。这些数据表明反复病毒感染训练了上皮细胞IL-6的释放增加。

4.4 IL6基因的低甲基化与IL6表达、释放增加以及体外和哮喘患者中的高IL6TS表达谱相关

为了将低IL6M与人类呼吸上皮中IL-6蛋白释放增加联系起来，我们用RV16感染原代鼻上皮细胞（NEC），比较ALLIANCE队列儿科组中的低和高IL6M组。与高甲基化组相比，低IL6M的细胞在RV16感染后释放出显著更多的IL-6蛋白（p < 0.01，图4A）。类似地，我们在气液界面（ALI）培养来自哮喘患者的原代支气管上皮细胞，按IL6M低（cg15703690 DNA甲基化 < 50th percentile）或高（cg15703690 DNA甲基化 ≥ 50th percentile，图S10A）分层。Poly(I:C)刺激导致IL6M低与IL6M高细胞中IL6表达显著增加（p < 0.05）。在模拟T2高样条件的IL-13刺激的组织培养中，IL6M效应持续存在（低 vs. 高，p < 0.05，图S10A）。

为了将这一基本机制从儿童转化到成人，我们随后分析了来自ALLIANCE队列成人组的NEC（表S3），并探讨了哮喘患者中低IL6M、增加的IL6表达和高IL6TS谱之间的关联。首先，我们根据IL6TS谱对患者进行聚类（图4B外环，表S5），随后比较IL6基因表达（图4B环形塔图，表S6）和甲基化（图4B内环，表S7）。首先，具有IL6TS高表达谱的IL6表达显著更高（图4C）。第二，低IL6M（67%的患者）与IL6TS高谱同时发生（卡方 p < 0.0001，图4D）。然后我们在另一个先前由Nicodemus-Johnson等人报道的独立队列（队列I）中确定了IL6M和IL6TS之间的强关联。

根据队列I中的IL6TS谱基因对受试者进行聚类（图S10B）。接下来，对IL6M进行细分，揭示了队列I中两个不同的亚组（图S11A）。低IL6M显著与IL6TS高谱同时发生（卡方 p < 0.05，图S11B）。主要地，在IL6TS高表达谱组中，cg15703690和cg01770232处的甲基化降低（p < 0.01，图S11C–F）。

总之，体外和离体数据提供了强有力的证据，表明低IL6M与人类NEC和BEC中高IL6基因表达和IL-6蛋白释放相关。此外，鼻子和支气管中的IL6TS高表达谱与哮喘患者的低IL6M相关。

4.5 哮喘患者呼吸上皮细胞中IL6基因低甲基化发生于T2高或低内型中，并与既往急性发作相关

先前显示IL6TS高的患者血液嗜酸性粒细胞水平升高，这与上皮T2高特征无关。ALLIANCE队列成人组中低IL6M的患者血液嗜酸性粒细胞百分比降低（p < 0.05，图5A），并且比IL6M高组年龄更大（p < 0.05，表S3），呼出气一氧化氮（图5B）、BMI或FEV₁%预测值没有显著差异（表S3）。

相反，队列I中低IL6M的患者血液嗜酸性粒细胞百分比更高（p < 0.05，图S12A），呼出气一氧化氮更低（p < 0.01，表S4），年龄、身高、体重、BMI或FEV₁%预测值没有显著差异（表S4）。

值得注意的是，STEP治疗等级在较低IL6M聚类中倾向于（n.s.）更高，这与队列I中低IL6M和哮喘严重程度增加之间的关联一致（表S2）。

接下来，我们分析了骨膜蛋白（POSTN）基因的表达，这是BEC中T2-高哮喘的已知特征。在ALLIANCE队列成人组中，低IL6M患者的POSTN表达没有显著差异（图5），但在队列I中低IL6M患者中增加（p < 0.05，图S12B）。成人ALLIANCE低IL6M患者具有中性粒细胞性哮喘的特征，表现为外周中性粒细胞计数升高（p < 0.05，表S3）和高白细胞介素1b（IL1B）表达（p < 0.0001，图5D）。在队列I中没有看到这种关联（n.s.，图S12C）。因此，我们发现研究访视前12个月内，低IL6M的ALLIANCE患者急性发作更频繁（p < 0.05，图5E）。这些综合数据表明，IL6M低表型可能发生在T2高或T2低内型中，并且与更严重的表型相关。

4.6 哮喘儿科患者呼吸上皮细胞中IL6基因低甲基化与未来急性发作相关

先前报道，具有高IL6TS的哮喘患者经历更多急性发作。在将高IL6TS与低IL6M联系起来之后，我们随后评估了NEC中低IL6M对ALLIANCE儿童未来急性发作的影响，进行了连续三次年度随访（FU）访视（表1）。儿科哮喘患者被聚类为高 versus 低IL6M（图S13A）。高IL6M的比例在低IL6TS versus 高中增加（卡方 p < 0.05，图S13B,C）。

总体而言，具有高IL6M的儿童具有相似的特应性和ICS使用水平，基线时报告了相似的GINA症状控制水平，并且总血清IgE、嗜酸性粒细胞血液浓度和肺功能参数与低IL6M儿童相似（表1）。高IL6M的儿童更可能是男性，并且基线时年龄显著大于低IL6M（p < 0.05）。

在随访期间，低和高IL6M低和高儿童之间总体差异很小，除了急性发作次数（表1）。高IL6M组中FEV₁有改善趋势，但低IL6M组中没有。此外，低IL6M亚组中血液嗜酸性粒细胞计数随时间显著增加，而在高IL6M中减少（FU3时p < 0.01）。在四次访视中，低IL6M（34名患者）患者发生急性发作（根据GINA问卷定义）的平均频率显著（p < 0.05）高于高IL6M（0%，19名患者，图5F）。支持疾病更严重的观点，在低IL6M组中，应急缓解药物使用（根据GINA问卷定义）的平均率（四次访视）显著高于高IL6M组（27.85% vs. 9.45%，p < 0.05；图5G）。此外，与低IL6M组相比，高IL6M组中ICS使用随随访显著减少（表1），GINA控制水平没有任何变化。这些发现表明，NEC中具有低IL6M的哮喘儿童急性发作风险更高，血液嗜酸性粒细胞水平升高，使用更多缓解药物，并且更不可能实现哮喘控制。

5 讨论

在本研究中，我们发现poly(I:C)诱导的实验性哮喘急性发作依赖于IL-6释放，并且反复暴露于poly(I:C)导致BECs的IL-6释放增加