创新性硒-氟他胺衍生物：增强对雄激素受体（AR）依赖性和非依赖性前列腺癌细胞的活性

《Archiv der Pharmazie-Chemistry in Life Sciences》：Innovative Se-Flutamide Derivatives: Enhanced Activity Toward Androgen Receptor (AR)-Dependent and -Independent Prostate Cancer Cells

本文推荐了一类新型硒-氟他胺衍生物，其通过将硒引入氟他胺骨架，显著增强了对雄激素受体（AR）依赖（LNCaP）和独立（DU-145、PC-3）前列腺癌细胞的抗增殖活性。化合物a5通过激活内源性和外源性凋亡通路诱导细胞凋亡，并引起G0/G1期细胞周期阻滞，且不依赖活性氧（ROS）生成，展现出良好的开发前景。

　　

引言

近年来，前列腺癌已成为男性中最常被诊断的肿瘤之一。雄激素、睾酮和5α-二氢睾酮（DHT）在前列腺细胞的生长和维持中扮演关键角色。许多前列腺癌依赖于雄激素与其受体（AR）的相互作用。因此，雄激素剥夺疗法（ADT）使用甾体或非甾体抗雄激素药物，已成为治疗局部前列腺癌的主要选择，反应率超过80%。非甾体药物（如氟他胺和比卡鲁胺）因其与孕激素和糖皮质激素受体相互作用产生不良反应较少而更受青睐。然而，许多患者最终会发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），这可能源于AR突变，预后较差，成为当前主要的临床难题。因此，研究人员迫切寻找针对激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞的新型有效且安全的治疗药物。当前应对这一挑战的实用方法之一是直接改造现有药物以改善其治疗特性和疗效。在此背景下，对非甾体抗雄激素（如氟他胺和比卡鲁胺）进行了多种修饰。将硒（Se）功能化基团引入众多活性分子中是药物化学的当前趋势，用以提高母体化合物的生物效应。此外，大量有机和无机硒化合物在前列腺癌细胞死亡和生长抑制中的作用在过去几年中引起了广泛兴趣。

结果与讨论

结构设计

本研究设计并合成了16种新型氟他胺类似物，分为三个系列：a（NSAIDs类似物）、b（单环取代基）和c（稠环衍生物）。所有化合物结构均包含三氟甲基取代的苯胺部分，这对多种非甾体抗雄激素化合物的生物活性至关重要。设计中引入了硒功能团，因为这种掺入在大多数情况下可增强母体化合物的生物活性。其中，选择硒酯官能团是因为其易于裂解，从而释放具有潜在生物活性的硒醇或硒醚中间体。

化学与表征

目标硒酯类似物通过先前报道的程序合成。简要来说，通过硼氢化钠（NaBH₄）在水中还原元素硒生成硒氢化钠（NaHSe）。当水溶液无色时加入相应的酰氯，确保仅NaHSe为中间体，反应混合物在室温下搅拌30-60分钟。产率取决于相应酰氯的水溶性。对于水溶性差的有机试剂，加入THF以提高产率。尽管反应混合物中可能形成其他硒化合物，如二酰基二硒化物和硒酸酐，但主要形成的硒化合物是硒酯，可通过色谱柱从其他含硒副产物中纯化。不可商购的酰氯通过相应羧酸与氯化亚砜或草酰氯反应制备，无需进一步纯化即可使用。最终衍生物通过溴化物中间体上的亲核取代获得，该中间体由3-(三氟甲基)苯胺在二氯甲烷（DCM）中与溴乙酰氯在三乙胺（TEA）存在下处理得到，无需进一步纯化。化合物通过硅胶柱色谱纯化，使用正己烷和乙酸乙酯梯度洗脱。某些系列衍生物纯化困难，这解释了产率的差异。所有化合物的结构表征通过¹H、¹³C和⁷⁷Se核磁共振（NMR）及2D-NMR实验确定。在¹H NMR谱中，可观察到两个微卫星信号，反映了与硒原子连接的–CH₂–信号中¹H与⁷⁷Se的耦合。此外，所有氟他胺类似物中最移向高场的峰对应于–NH，出现在9-11 ppm。在¹³C NMR谱中，发现与–CF₃基团相关的特征四重峰信号位于124-135 ppm（J_C-F = 271-273 Hz），以及其他由于更远碳原子被相同氟原子分裂而产生的耦合常数较小的四重峰。值得注意的是，¹³C和¹⁹F耦合常数与文献报道一致。此外，所有化合物中最移向低场的峰对应于硒酯键的羰基，化学位移总体在180-209 ppm之间。酰胺官能团的羰基峰在所有化合物中几乎出现在相同位置，为167-169 ppm的尖锐峰，除了化合物c2，其出现在更低场（178 ppm）。属于–CH₂–的信号出现在28-44 ppm，在某些情况下位于溶剂信号之下。最移向低场的峰对应于布洛芬（44.2 ppm）和吲哚美辛（41.5 ppm）衍生物。在⁷⁷Se NMR中，所报道衍生物的硒峰化学位移出现在537-579 ppm范围内，彼此之间无显著差异。所有衍生物在室温下至少稳定6个月。

X射线晶体学

进行X射线衍射研究以明确确定代表性化合物b3（CCDC: 2491364）和c2（CCDC: 2491365）的结构和晶体堆积。

生物学评价

NCI-60人类癌细胞系筛选程序中的单剂量测定

作为确定新合成硒酯可能抗增殖特性的初步方法，通过美国国家癌症研究所（NCI）-60人类癌细胞系筛选平台测定了它们对细胞活力的影响。结果以处理细胞（10 μM浓度，48小时处理）的生长抑制百分比与未处理对照的生长百分比（GP）的比率表示。值得注意的是，GP值在0%至50%区间表示抗增殖特性，接近0%意味着细胞静止效应，介于0%至-100%表示化合物具有细胞毒性。为清晰起见，图5提供了此初步筛选结果的摘要，而图6显示了在NCI-60癌细胞系 panel中获得的平均生长抑制值。除衍生物a6、b1、b2和b3外，所有化合物对几乎所有细胞系均表现出出色的细胞毒活性。然而，这些活性化合物在不同癌症子 panel中的测试细胞系内表现出不同的行为（细胞毒性和抗增殖性）。除a6外，所有化合物的结肠子 panel平均生长抑制值最高。有趣的是，在所有化合物中，仅a5和b4对白血病子 panel中的K-562细胞表现出显著的抗增殖活性，GP值分别为-81.86%和-81.77%。化合物a6在白血病HL-60(TB)细胞系中表现出强效和选择性的细胞毒活性。应注意的是，NCI-60中的一系列耐药细胞系对大多数报告的硒酯敏感。所有化合物在SNB-19、SK-MEL-28、EKVX、A498和DU-145细胞系中均表现出细胞毒行为。显著的是，至少一种耐药乳腺癌细胞系（BT-549、HS 578T和MDA-MB-231）对所有测试化合物敏感。此外，几乎所有化合物对TK-10、SK-OV-3、OVCAR-5、SK-MEL-2、SF-268和NCI-H226均表现出细胞毒活性。最耐药的结肠癌细胞系HCC-2998对化合物a2、a3、a4、a7、b4和c5敏感。

五剂量测定

由于所有化合物均满足NCI单剂量筛选的阈值抑制参数，因此进行了进一步研究。在NCI-60细胞 panel中以五种浓度（0.01、0.1、1、10和100 μM）测试衍生物，以确定其剂量-反应曲线以及三个反应参数[50%生长抑制浓度（GI₅₀）、总生长抑制浓度（TGI）和50%致死浓度（LC₅₀）]。GI₅₀值定义为导致净细胞生长减少50%的衍生物浓度，TGI值（细胞静止活性）对应于完全抑制细胞生长的浓度，LC₅₀值（细胞毒活性）是导致孵育期结束后初始细胞损失50%的浓度。所有化合物的五剂量分析结果在支持材料中提供。每个子 panel的这些参数的平均值（以μM计）呈现在图7-9中。值得注意的是，所有化合物在整个 panel中均表现出强效抗癌活性，平均GI₅₀值（1.55–5.40 μM）低于在同一 panel细胞系中使用的5-氟尿嘧啶（NSC 19893）（18 μM）。同样，所有报告的硒衍生物（除b1和b3外）也表现出低于临床使用的其他细胞毒药物吉非替尼（NSC 715055）（3.2 μM）和奥沙利铂（NSC 266046）（2.8 μM）的平均GI₅₀值。从图7报告的数据的一般考虑来看，b系列的化合物呈现的GI₅₀值低于其相应的c系列类似物。值得注意的是，唯一带有脂肪族取代基的有机硒化合物（b1）比本文报道的其他衍生物效果差。数据的另一个有趣点是，五种报告的硒酯（a1、c1、c2、c3和c4）对NCI-60中的几种耐药细胞系显示出低微摩尔范围的GI₅₀值。化合物c1、c2、c3和c4对最耐药的结肠癌细胞系HCC-2998的GI₅₀值分别为0.42、0.60、0.46和0.43 μM。同样，a1对UACC-2557黑色素瘤细胞系的GI₅₀值为0.99 μM。衍生物c3和c4对OVCAR-4卵巢癌细胞系表现出巨大的生长抑制活性，GI₅₀值分别为0.50和0.70 μM。对TGI数据的检查显示，除阿司匹林（ASA）衍生物（a6）外，a和c库的化合物呈现的总体平均TGI值范围为3至5 μM。另一方面，b3与吉非替尼相当，它们的平均TGI值分别为17.4和19 μM。关于LC₅₀值，可以观察到来自不同子 panel的多种癌细胞对a6和b3更具耐药性。

基于来自NCI的DTP的两项测定的有希望发现，选择a2、a5、b4和c3作为代表性化合物，以更深入地了解它们作为抗前列腺癌抗癌药物的潜在用途。

对雄激素依赖性LNCaP细胞系的抗增殖活性

如上所述，来自NCI-60细胞系 panel的筛选表明，许多癌细胞系有效地响应报告的有机硒化合物。尽管需要更深入地研究不同的敏感癌细胞系以了解潜在机制，但本文专注于前列腺癌。主要选择原因是NCI-60 panel仅包含雄激素受体（AR）非依赖性DU-145和PC-3细胞系，我们的化合物对其表现出显著的抗癌活性，并且我们认为评估它们在雄激素依赖性LNCaP细胞系中的抗增殖活性也很有趣。此外，基于这些有机硒化合物设计的氟他胺已用于AR依赖性前列腺癌。据广泛报道，这些细胞中的AR基因在配体结合域包含一个点突变。因此，AR不仅可以被几种抗雄激素（例如氟他胺）激活，还可以被雌激素和孕激素激活。LNCaP和非恶性HaCaT细胞用不同浓度（1、2.5、5、10、25、50和100 μM）的a2、a5、b4和c3处理，使用[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓]（MTS）生物测定法确定它们各自的抗增殖活性和选择性指数（SI）。每种化合物的SI使用公式计算：SI = （非恶性系HaCaT的IC₅₀）/（LNCaP细胞系的IC₅₀）。如表1所示，所有有机硒化合物与未修饰药物相比，对LNCaP细胞表现出显著的活性。此外，它们对测试的细胞系显示出显著的选择性，SI值在二和三之间。为了进一步支持在MTS测定中观察到的a2、a5、b4和c3的抗增殖效应，我们在LNCaP细胞中进行了台盼蓝染料排斥试验。细胞用每种化合物的三种浓度（5、10和25 μM）处理，处理48小时后测定存活细胞的百分比。如图10所示，细胞活力以剂量依赖性方式降低，这与我们之前的发现一致。鉴于前者，a5在评估的硒衍生物中脱颖而出，因为它在该细胞系中显示出显著的有效性（IC₅₀值低于10 μM）和对HaCaT细胞的可接受细胞毒性，IC₅₀为28.71 μM，证明是最具选择性的化合物（SI为3.23）。因此，选择这种Se-尼氟酸衍生物进行进一步的生物学研究。

调节性细胞死亡抑制剂

为了初步了解a5诱导的调节性细胞死亡类型，我们通过将我们的硒化合物与不同的细胞死亡抑制剂组合并进行细胞毒性测定，测量其在LNCaP细胞中细胞毒活性的变化。因此，我们使用了：ferrostatin-1，一种脂质过氧化和铁死亡抑制剂；wortmannin，一种自噬抑制剂；Z-VAD-FMK，一种泛半胱天冬酶抑制剂；和Y-27632，一种选择性Rho激酶相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂。不同抑制剂的浓度和孵育时间基于先前报道的文献确定。LNCaP细胞用相应的抑制剂（10 μM）预处理，并在37°C孵育1小时。此后，用a5的IC₅₀值处理细胞48小时。未处理以及仅用抑制剂或a5处理的细胞用作对照。图11中表示的数据表明，用ferrostatin-1、Z-VAD-FMK和Y-27632处理可保护LNCaP细胞免于由a5引起的死亡；因此，这种硒化合物可能通过几种类型的调节性细胞死亡发挥其抗增殖活性。ferrostatin-1预处理随后暴露于a5的IC₅₀浓度后观察到的细胞活力增加表明铁死亡可能有助于细胞死亡。另一方面，众所周知，Z-VAD-FMK是一种广泛使用的半胱天冬酶活性抑制剂，半胱天冬酶在凋亡过程中起关键作用。因此，半胱天冬酶依赖性凋亡也可能是与a5相关的可行作用机制。此外，当与选择性ROCK抑制剂Y-27632组合时，所研究化合物的抗增殖活性减弱。几份报告表明，ROCK对于各种细胞类型中内在和外在凋亡过程的各个方面至关重要。因此，为了进一步证实和理解a5在该前列腺癌细胞系中抗增殖效应的分子机制，需要更多研究。

化合物a5在雄激素依赖性LNCaP前列腺癌细胞中诱导凋亡

先前描述的细胞活力测定证明a5表现出强大的抗增殖活性。进行Annexin V & Dead Cell和Caspase 3/7测定以进一步研究该化合物是否可通过凋亡诱导细胞死亡。众所周知，Annexin V是一种磷脂结合蛋白，广泛用于检测凋亡细胞死亡，因为它对凋亡细胞膜外层暴露的磷脂酰丝氨酸（PS）残基具有高亲和力。此外，7-氨基放线菌素D（7-AAD），一种能够与双链DNA结合的荧光DNA结合染料，用于排除坏死和晚期凋亡细胞，因为它染色其受损的膜完整性。Annexin V和7-AAD的双重染色指示哪些细胞已经死亡或处于凋亡晚期。另一方面，半胱天冬酶是在调节细胞死亡中起关键作用的蛋白水解酶。参与凋亡过程的半胱天冬酶根据其作用机制被细分为起始或执行半胱天冬酶。Caspase-3和caspase-7属于后者，它们的激活导致许多底物组的切割，从而产生凋亡的特征性标志。基于先前为a5确定的IC₅₀值，用10 μM该化合物处理LNCaP细胞24和48小时。实验按照制造商方案进行，结果汇编于图12A,B。流式细胞术分析区分了四种不同的细胞群：坏死细胞[Annexin V和Caspase 3/7阴性且7-AAD阳性（左上象限）]；晚期凋亡或死亡细胞[Annexin V、Caspase 3/7和7-AAD阳性（右上象限）]；健康细胞[Annexin V、Caspase 3/7和7-AAD阴性（位于左下象限）]；和早期凋亡细胞[Annexin V和Caspase 3/7阳性且7-AAD阴性（位于右下象限）]。此外，两种处理时间之间细胞群差异的定量分析显示于图12C,D。用载体（DMSO）处理的细胞在两个测定中主要位于左下象限，并用作阴性对照。在Annexin V & Dead Cell测定（图12A,C）中，用a5处理诱导细胞从健康状态向凋亡状态转变。结果显示，在48小时处理结束时，凋亡细胞的比例显著增加，表明a5-凋亡是时间依赖性的。晚期凋亡/死亡细胞的百分比从对照中的0.75%上升到用硒化合物处理48小时后的28.90%。处理48小时后，早期凋亡群体也显著增加。值得注意的是，在处理结束时仅检测到一小部分坏死细胞（0.80%–4.05%）。关于Caspase 3/7测定，当用a5处理24和48小时时，分别有35.71%和43.05%的细胞处于晚期凋亡/死亡阶段。总之，在两个测定中获得的结果，连同a5在LNCaP细胞中显示的抗增殖效应，强烈表明凋亡可能是该测试化合物在该细胞系中诱导细胞死亡的潜在机制，并明显涉及caspase 3/7。为了更深入地了解命中化合物在LNCaP细胞中诱导凋亡的分子机制，进行了蛋白质印迹分析。因此，我们评估了化合物a5（10 μM）对pro-caspase 3、pro-caspase 9、caspase 3、caspase 9、caspase 8和BAX表达水平的影响。如图12E,F所示，用测试化合物处理48小时导致caspase-3和caspase-9无活性形式的水平降低。相反，我们观察到BAX水平显著增加。此外，结果显示，与对照细胞相比，用a5处理后，caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达分别增加了3.66、2.36和1.22倍。这些结果表明内在和外在途径均被激活，对第一条途径的影响更为突出，因为caspase-9水平更高且促凋亡BAX蛋白上调。

化合物a5在24小时处理期间边际诱导ROS产生

接下来，我们旨在确定a5是否通过细胞内ROS产生诱导凋亡。如先前所述，我们使用Muse?氧化应激试剂盒测量了LNCaP细胞在用DMSO（阴性对照）、H₂O₂（阳性对照）或a5（10 μM）处理12和24小时后的ROS产生。直方图（图13A）显示两个不同的细胞群：ROS阴性（ROS?；M1峰/蓝色）和ROS阳性（ROS+；M2峰/红色）细胞。如图13所示，用a5处理并未导致两个时间点之间的总ROS水平发生显著变化，在12和24小时时分别达到约13%和15%的ROS（+）细胞。这些结果表明a5诱导的凋亡可能是ROS非依赖性的。

化合物a5通过诱导细胞周期阻滞抑制LNCaP细胞生长

为了进一步阐明a5诱导的LNCaP前列腺癌细胞活力降低的潜在机制，通过流式细胞术分析了细胞周期。处理前，通过血清饥饿48小时将细胞同步在G0/G1期。随后，用a5的IC₅₀浓度处理细胞48小时。对照细胞提供新鲜补充培养基。流式细胞术显示，a5通过将细胞阻滞在G0/G1期来抑制细胞周期进程（图14）。该阶段的细胞百分比从41.6%（对照组）增加到用硒化合物处理的细胞的69.8%。对照组中处于细胞周期G2/M期的细胞百分比为15.8%，而在用硒化合物处理的细胞中，为3.3%。同样，处于S期的细胞百分比减少。

计算机研究：药物相似性和ADMET预测

使用SwissADME和ADMETlab 3.0算法预测了化合物a5的理论ADMET profile。根据Lipinski五规则，一种口服活性药物最多只能违反以下主张之一：分子量（MW）≤ 500，分配系数≤ 5，≤ 5个氢供体（nHD），和≤ 10个氢受体（nHA）。化合物a5满足其中四个标准，其MW为547.02 g/mol。此外，a5未显示泛 assay干扰物质（PAINS）警报，并被预测为p-糖蛋白（Pgp）底物。它还被预测无肝毒性或与心脏毒性、眼睛刺激和腐蚀相关的参数，以及药物诱导的神经毒性。这种硒衍生物显示出良好的合成可及性评分（SA评分），这是用于评估类药物分子合成难易程度的指标。尽管Caco-2细胞通透性结果表明a5不具有最佳膜通透性，但计算的人类肠道吸收（HIA）值表明其具有通过肠道膜有效吸收的高可能性。这种硒衍生物在血浆蛋白结合（PPB）中的分布为96.05%，具有正常分布容积（VD）和低血脑屏障（BBB）渗透。排泄参数显示平均清除率中等，半衰期短。此外，AMES毒性 profile显示a5不具有毒性潜力。完整报告显示在支持材料的图S145和表S9中。

结论

总之，将硒引入氟他胺骨架产生了具有前景抗癌活性的强效类似物。与氟他胺相反，化合物a2、a5和b4抑制LNCaP细胞的增殖，这通过MTS和台盼蓝染料排斥试验证实。这一发现表明我们的硒类似物可能有效拮抗突变的AR，或通过不依赖于AR的机制起作用。此外，根据NCI数据，它们对AR非依赖性DU-145和PC-3细胞系显示出抗增殖效应，强化了它们观察到的抗癌活性不仅仅依赖于AR抑制的假设。由于a5是对LNCaP细胞最有效和选择性的衍生物，进行了涉及几种细胞死亡抑制剂的细胞毒性测定，以初步了解该化合物在该细胞系中诱导的可行调节性细胞死亡类型。此外，a5通过caspase 3/7活性和这些癌细胞外膜上PS的存在证明的凋亡机制诱导LNCaP细胞死亡。这种Se-氟他胺类似物还通过将细胞阻滞在G0/G1期来抑制LNCaP细胞的生长。总体而言，我们的结果表明将硒引入氟他胺骨架（i）显著增强了对几种癌细胞系的效力，同时增加了SI，（ii）赋予了对AR依赖性和非依赖性前列腺癌细胞系的活性，与用于AR依赖性肿瘤的氟他胺不同，和（iii）可能最小化了与氟他胺相关的肝毒性问题。尽管需要更多研究，但这些发现强调了a5作为进一步临床前评估和开发为前列腺癌和潜在其他癌症的新型治疗剂的可行候选者的潜力。

实验部分

化学

所有试剂均从商业供应商获得，除非另有说明，否则无需进一步纯化即可使用。每个反应的进程通过薄层色谱（TLC）板监测，并使用紫外（UV）灯（λ = 254 nm）可视化斑点。合成化合物的化学结构通过¹H、¹³C、⁷⁷Se和HMQC NMR（参见支持信息）确定，使用Bruker Avance Neo 400 MHz操作，分别在400、100和76 MHz下，使用氘代溶剂：氯仿（CDCl₃）、丙酮-d₆ ((CD₃)₂CO)或二甲基亚砜（DMSO-d₆）。化学位移（δ）以相对于内部四甲基硅烷（TMS）在0.00 ppm的低场以百万分率（ppm）表示。耦合常数（J）以赫兹（Hz）报告。使用指示多重性的标准缩写如下：s = 单峰，bs = 宽单峰，d = 双峰，dd = 双双峰；ddd = 双峰的双峰的双峰，q = 四重峰，和 m = 多重峰。¹H NMR信号参考残留质子（CDCl₃为7.26 ppm，DMSO–d₆为2.50 ppm，或丙酮-d₆为2.05 ppm）的氘代溶剂，对于¹³C NMR谱，使用CDCl₃（77.16 ppm）、DMSO–d₆（39.52 ppm）或丙酮-d₆（206.26 ppm）的信号作为参考。熔点（mp）在Metler FP82+FP80 apparatus上获得。碳（C）、氢（H）和氮（N）的元素分析在Thermo Fisher FlashSmart?元素分析仪上进行。化合物的纯度通过高分辨率质谱（HRMS）评估，使用带有电喷雾电离源的三重四极杆质谱仪（6410 Agilent Technologies）。数据采集参数（即监测离子对、碎片电压和碰撞能量）针对每种化合物进行了优化。所研究化合物的InChI代码以及一些生物活性数据作为支持信息提供。

目标硒酯类似物按照先前报道的程序合成。简要来说，将硼氢化钠（9.4 mmol）在12.5 mL蒸馏水中的溶液加入到在12.5 mL蒸馏水中搅拌的灰色硒（4.7 mmol）悬浮液中，在室温下。反应混合物搅拌直至形成几乎无色的NaHSe溶液。然后，加入相应的酰氯（4.7 mmol），反应混合物在室温下磁力搅拌30-60分钟。如果酰氯不可商购，则先前从其相应的羧酸合成并无需进一步纯化即可使用。此后，将相应的卤化物（4.7 mmol）加入反应中，混合物在室温下搅拌过夜。该中间体按照先前描述制备并无需进一步纯化即可使用。最终粗产物通过用DCM（3 × 20 mL）萃取分离。合并的有机相用水（2 × 30 mL）洗涤，随后用无水硫酸钠干燥。溶剂通过旋转蒸发