感染性眼内炎重复眼内取样与微生物检测的临床价值：一项27年前瞻性观察研究

《Clinical & Experimental Ophthalmology》：Repeat Intraocular Sampling and Microbiological Testing in Infectious Endophthalmitis: A 27-Year Prospective Observational Study at an Australian Statewide Tertiary Referral Centre

本刊推荐：这项为期27年的前瞻性观察研究（n=317眼）首次系统分析了感染性眼内炎中重复眼内取样（包括房水穿刺aqueous tap和玻璃体穿刺vitreous tap）的诊断价值。研究发现二次干预总体培养阳性率达34.7%，首次玻璃体阴性者中19.5%二次取样转阳。葡萄球菌（Staphylococcus，40.4%）和链球菌（Streptococcus，31.3%）为主要病原体，研究为临床难治性眼内炎的精准诊疗提供了重要循证依据。

　　

引言

感染性眼内炎是一种由细菌或较少见的真菌引起的威胁视力的眼内感染。它可发生于眼内手术后、穿透性眼损伤、角膜溃疡、外伤或通过血行传播。由于病情的紧迫性，眼内炎通常在初步临床诊断后经验性地使用广谱眼内抗生素治疗。病原体及其抗菌药物敏感性的鉴定非常重要，特别是在治疗无反应的病例中，以指导后续管理，包括是否需要进行玻璃体切除术以及后续抗菌药物注射的需要。目前，病原体鉴定的金标准是在眼内注射前获取初始玻璃体样本。

然而，玻璃体培养并非总是可行，文献中报道的玻璃体培养阳性率在48.2%至88.8%之间。房水穿刺的敏感性较低，据报道在20%至71.4%之间。虽然外源性眼内炎的持续培养阳性率较低，据报道为3%，但后续玻璃体培养的效用，特别是在初始培养阴性的眼内炎中，尚未得到充分研究。

目前，对于治疗无反应或初始培养阴性的眼内炎病例，获取第二次或后续眼内样本进行微生物学分析的适应症或时机尚无既定指南。据我们所知，尚无先前研究探讨重复眼内取样在感染性眼内炎中的潜在临床价值。因此，本研究旨在调查在临床具有挑战性的病例中，从不同眼内样本获取的第二次或后续微生物学标本的培养阳性率以及分离出的微生物，以期利用这些发现来指导临床管理。

方法

我们进行了一项前瞻性观察性队列研究，数据来源于维多利亚州眼内炎登记库，该登记库记录了所有就诊于澳大利亚维多利亚州墨尔本皇家维多利亚眼耳医院（RVEEH）的眼内炎病例。该数据库创建于1997年。

本研究的纳入标准为在1997年7月13日至2024年6月20日期间临床诊断为眼内炎，并接受了两次或以上房水或玻璃体取样的患者。样本包括玻璃体液、房水以及玻璃体切除术时获取的液体，如玻璃体灌洗液、玻璃体活检组织和房水活检组织。首次培养阳性或阴性的患者均被纳入，包括来自增菌肉汤的培养结果。我们纳入了在重复穿刺时接受和未接受眼内抗生素注射的患者。在第二次玻璃体样本采集前接受眼球摘除术或眼内容剜除术的患者被排除在外。

人口统计学数据、检查结果、诱发因素、临床危险因素、微生物学结果、治疗和结局均被收集到维多利亚眼内炎登记库中，这是一个前瞻性维护的数据库。记录的治疗细节包括治疗日期、微生物学结果、眼内注射和任何外科手术。对微生物学结果进行了人工审查以确保准确性。不明确的结果与资深合著者澄清。微生物学分析由澳大利亚维多利亚州墨尔本圣文森特医院的圣文森特病理科进行。

数据使用REDCap数据管理软件存储，要么直接录入，要么从旧的纸质记录迁移而来并检查准确性。符合我们纳入和排除标准的人群从REDCap中提取，并使用Microsoft Excel进行分析。统计分析和计算使用R软件和Microsoft Excel进行。不完整的数据被排除在统计分析之外。

我们识别了混杂因素，如年龄、糖尿病、免疫状态以及每次眼内取样之间的时间间隔，但由于我们专注于该人群的微生物学分析，并未对这些因素进行控制。

本研究获得了RVEEH人体伦理研究委员会的伦理批准。研究依据《赫尔辛基宣言》进行。

结果

在27年间，共有1484名眼内炎患者登记在数据库中。根据纳入和排除标准，最终纳入了314名患者的317只眼。人口统计学特征如表1所示。平均年龄为71.1岁（标准差未提供），年龄范围为9至99岁。63名（19.9%）患者患有糖尿病（1型和2型），其中36.5%为胰岛素依赖型。所有8名有记录的静脉吸毒（IVDU）患者均表现为内源性眼内炎。

表2显示了总人群（n=317）和第二次玻璃体穿刺培养阳性亚组（n=99）的眼内炎诱发因素。2名复发性眼内炎患者作为独立事件进行分析。在这两个人群中，眼内注射手术是主要诱因（分别为32.5%和34.3%），其次是由白内障和/或人工晶体手术引起的眼内炎（分别为26.2%和25.2%）。第三大诱因是青光眼手术，占总人群的13.6%。

表3描述了总人群（n=317）中首次玻璃体和房水穿刺培养阳性和阴性的比例。培养阳性穿刺包括任何在培养基上生长的微生物，包括增菌肉汤。仅存在多形核白细胞被视为阴性结果。我们发现，72.6%的初始玻璃体穿刺样本培养呈阳性，而房水穿刺的阳性率为37.5%。在41只首次玻璃体样本培养阴性的眼中，有10只眼（24.4%）对应的房水培养呈阳性。表3中既非培养阳性也非培养阴性的眼睛被排除在首次干预时玻璃体和/或房水穿刺的统计分析之外，但由于符合纳入标准，仍被计入总人群。

表4显示了总人群、外源性和内源性眼内炎人群的培养阳性率。对所有眼内样本的培养阳性率分析显示，初始培养阴性的患者中有四分之一（25%）在第二次干预时呈现阳性结果。玻璃体穿刺在两次干预中贡献了大部分培养阳性结果。第二次干预时玻璃体培养的净阳性率为19.5%，有8只眼仅在第二次干预时玻璃体培养呈阳性。尽管外源性和内源性人群的规模不同（n=283和n=34），但净培养阳性率相当（分别为23.5%和28.6%）。有2只内源性眼内炎的眼仅在第二次穿刺时玻璃体培养呈阳性。

表5显示了首次及后续玻璃体穿刺中阳性和阴性培养的分布（n=271）。在230份初始培养阳性的玻璃体标本中，第二次穿刺呈阳性和阴性的分布近乎相等，分别为33.1%和36.1%。第二次穿刺之后，阴性结果多于阳性结果，除了第五次穿刺各有1例阳性和阴性结果。有8只眼（占首次玻璃体穿刺阴性眼的19.5%）在第二次干预时培养呈阳性。

表6显示了首次及后续房水穿刺中阳性和阴性培养的分布（n=262）。我们注意到，4.2%的初始房水培养阴性的眼在第二次穿刺时呈阳性。第二次穿刺之后，房水液未再出现阳性培养，但第四次房水穿刺取样中有2.8%的阴性结果。没有患者接受超过四次房水穿刺。

总体而言，玻璃体穿刺的阳性率是房水穿刺的两倍，玻璃体样本的阳性率为84.9%，而房水样本为45.2%。

表7显示了第二次培养结果的概率。对于玻璃体穿刺培养，在首次阳性之后，获得第二次阳性和阴性培养的概率几乎相等（p=0.48和0.52）。对于房水穿刺样本，在首次阳性之后，第二次穿刺阳性的概率为p=0.31，显著低于阴性概率（p=0.69）。初始培养阴性后，后续培养阳性的概率在玻璃体和房水培养中分别为p=0.23和p=0.12。在房水和玻璃体取样中，连续两次阴性样本的概率均超过一半，房水为p=0.88，玻璃体为p=0.77。

表8和表9分别显示了在初始玻璃体培养阴性和初始房水培养阴性亚组中，第二次干预时获取的不同眼内样本的结果。在第二次穿刺中，玻璃体培养阳性百分比高于房水培养（分别为19.5%和4.9%）。虽然41.5%的第二次玻璃体样本革兰氏染色阳性，但只有19.5%有对应的阳性玻璃体培养结果。相比之下，96.6%的首次玻璃体穿刺样本同时具有革兰氏染色和培养阳性结果。作为二次手术的玻璃体切除术中获取的玻璃体灌洗液和切割头活检组织，在首次玻璃体培养阴性后，产生了12.2%的阳性培养率。总体而言，在该组中，第二次房水穿刺培养的总结果产出率为31.7%，其中阳性结果为4.9%。

在首次房水穿刺培养阴性后，42只眼（29.4%）的第二次玻璃体穿刺培养呈阳性。其中，32只眼有对应的玻璃体液革兰氏染色阳性结果（76.2%）。在第二次穿刺组中，玻璃体灌洗液和切割头活检样本的阳性培养率为14%。

表10和表11总结了从总人群以及外源性和内源性眼内炎组中首次和第二次玻璃体穿刺培养分离出的致病微生物。革兰氏阳性菌占首次阳性玻璃体培养结果的84.3%（来自194只眼），在第二次阳性玻璃体穿刺组（79只眼）中占79.8%。葡萄球菌分别占首次和第二次玻璃体培养所有感染的40.4%和44.4%。紧随葡萄球菌感染之后，链球菌是第二大致病菌，分别占首次和第二次阳性玻璃体培养结果的31.3%和17.2%。37份首次玻璃体标本生长出革兰氏阴性菌（16.1%）。铜绿假单胞菌分别占首次和第二次穿刺培养的3.9%和5.1%。流感嗜血杆菌在首次穿刺组中有9只眼（3.9%）生长，而在第二次穿刺组中仅有1只眼（1%）。真菌性眼内炎分别占首次和第二次阳性玻璃体穿刺培养的4.3%和11.1%。在外源性眼内炎人群中，87.9%的培养物为革兰氏阳性，15.8%为革兰氏阴性。在内源性眼内炎组中，真菌是分离到的主要致病菌（46.7%）。

表12显示了首次阳性房水穿刺培养鉴定出的微生物。在119只眼的首次房水穿刺培养中，有44只眼（37.0%）生长出链球菌。铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌各占5.9%，是该组中革兰氏阴性菌的最大比例。表10-12中概述的培养分离株趋势在外源性眼内炎人群（n=215）中相似，该人群构成了首次阳性玻璃体培养总人群（n=230）的大部分。

讨论

本研究分析了单一机构中接受至少两次玻璃体和/或房水取样的眼内炎患者。据我们所知，尚无其他研究探讨眼内炎中的重复眼内取样。这项前瞻性观察性研究的时间跨度长达27年，使得317只眼得以被研究。长时间跨度和大样本量是本研究的长处。这使得可以对多达6次连续的玻璃体和房水样本进行严格分析。此外，由于RVEEH是全州眼部感染的 tertiary 转诊中心，维多利亚州几乎所有的眼内炎病例都在此治疗。因此，本研究能够提供维多利亚州几乎所有眼内炎患者的数据，从而限制了该亚组分析中的选择偏倚。

初始干预和后续干预之间的间隔因患者的临床表现和疾病进展而异。当临床需要时，通常在初始治疗48小时后进行第二次穿刺注射程序。玻璃体切除术可以在任何时间点进行，但在涉及强毒力病原体或严重感染的情况下，通常在24小时内进行。

我们分析了所有培养结果，包括来自增菌培养基的结果，以提高微生物检测的准确性。Daur等人的研究表明，与仅使用常规平板培养相比，使用增菌技术可将阳性培养率从9.7%提高到23.1%，减少了假阴性结果。

微生物学检测的三种方式是革兰氏染色、培养基或肉汤培养以及根据需要进行的抗菌药物敏感性试验。尽管革兰氏染色是微生物学检测的关键步骤，但有许多混杂变量会影响其结果的判读，例如涂片质量和脱色时间。发表在《美国医学会杂志》上的一项前瞻性研究发现，来自玻璃体或房水样本的阳性革兰氏染色强烈预示着阳性培养结果。相反，阴性革兰氏染色在预测阴性培养结果方面可靠性较低。在我们的研究中，首次穿刺之后的革兰氏染色和培养结果之间存在差异。第二次玻璃体穿刺样本中，只有19.5%的革兰氏染色阳性样本产生了对应的阳性培养结果，而首次玻璃体穿刺样本的这一比例为96.6%。这项研究揭示，重复革兰氏染色的诊断价值较低。这部分可能是由于感染负荷较低以及上述因素造成的。

我们的发现强调了在就诊时进行房水取样作为玻璃体取样有用补充的价值。在我们的队列中，37.5%的患者在初始取样时房水培养呈阳性，而玻璃体培养阳性率为72.5%。这些比率显著高于一项更大规模的队列研究，后者报道房水样本阳性率为22%，玻璃体样本为32%。在41只初始玻璃体穿刺阴性的眼中，有10只眼房水培养呈阳性，约占该组的24.4%。虽然Sjoholm-Gomez de Liano等人指出房水取样仅具有中等敏感性和特异性，不应单独用于诊断眼内炎，但我们的结果表明它仍然可以提供重要的诊断信息。在某些情况下，在房水样本中检测到了相应玻璃体标本中未鉴定出的病原体，进一步证明了其潜在的诊断作用。然而，由于微生物学产出更高，玻璃体取样仍是金标准。房水穿刺风险相对较低——尤其是在人工晶体眼患者中——并且当玻璃体取样失败时（例如干抽时）尤其有价值，此时阳性房水培养仍可提供必要的诊断信息。

在初始玻璃体培养阴性的患者（n=41）中，仅对房水样本的分析显示，阳性培养率从第一次穿刺的24.4%下降到第二次的仅4.9%。值得注意的是，第二次取样之后未再获得阳性房水培养，这表明超过前两次的额外房水穿刺诊断价值微乎其微。

对所有眼内样本的培养阳性率分析显示，25%的初始培养阴性患者在第二次干预时呈现阳性结果。具体而言，第二次干预时总体玻璃体培养阳性率为31.2%。现有文献中关于此主题的数据有限。作为比较，眼内炎玻璃体切除术研究（EVS）报道了眼内炎病例中第二次玻璃体穿刺的阳性率为42%。基于这些发现，我们建议在炎症或感染恶化的情况下，进行额外治疗（如重复眼内抗生素注射或玻璃体切除术）时，获取第二次眼内样本。初始阴性结果后的阳性培养具有诊断意义，而初始阳性结果后的重复阳性培养可能表明感染持续存在或疾病更严重。

本研究还证明了在第二次干预时对手术标本进行微生物学检测的益处，特别是在初始培养阴性之后。作为二次手术的玻璃体切除术中获取的玻璃体灌洗液和切割头活检组织，在首次玻璃体培养阴性后，产生了12.2%的阳性培养率。Barza等人报告了类似的观察结果，在420名患者中，分别有4.2%和8.9%的患者仅有房水或玻璃体切除液阳性，而相应的穿刺培养为阴性。

该人群中大部分病原体与已知的常见革兰氏阳性菌一致，第二次玻璃体穿刺阳性培养结果中分离出44.4%的葡萄球菌和17.2%的链球菌。革兰氏阳性菌的毒力源于直接激活炎症通路导致眼组织破坏，例如激活Toll样受体（TLRs）和刺激促炎介质。链球菌因其多糖荚膜而具有特别强的毒力。金黄色葡萄球菌具有额外的毒力因子——α毒素，已在动物和人体模型中被鉴定出来。它被认为是促炎细胞因子白介素-17的有效诱导剂。据推测，肺炎链球菌通过肺炎球菌溶血素（pneumolysin）激活TLR2和TLR4，从而参与眼部免疫反应。

在首次和第二次穿刺培养中，真菌性眼内炎的眼数相等。这可能是因为毒力增强或初始眼内抗生素治疗不足，或存在免疫抑制等混杂因素。氟康唑和伏立康唑在眼内和全身给药时已被证明具有良好的眼内浓度和安全性，并在我们中心常规使用。

值得注意的是，某些特定微生物在第二次及后续样本中被更频繁地鉴定出来。这可能是由于微生物的免疫表型特征导致抗菌药物耐药性或眼内免疫反应。假单胞菌和念珠菌是显示持续培养阳性的两个例子。铜绿假单胞菌已知表现出几种可能有助于持续培养阳性的毒力因子，包括生物膜形成、磷脂酶产生、特定运动性和特征性抗生素敏感性模式。生物膜是微生物在生命或非生命表面相互粘附并嵌入自身产生的细胞外聚合物基质中的聚集体。在生物膜中生长的微生物细胞对抗菌药物和宿主免疫反应的敏感性低于在自由悬浮液中生长的细胞。生物膜的强度进一步促进了抗生素耐药性，一项关于白内障术后眼内炎的研究证明了这一点。重复培养中白色念珠菌的持续存在可能是由于普遍抗真菌药物过度使用导致的唑类耐药性出现。一项使用多位点序列分型的研究鉴定出，属于克隆复合体1、二倍体序列型69（DST69）作为推定的始祖的白色念珠菌在眼内炎中更为富集，并且是念珠菌感染（包括眼部念珠菌病）的全球首要原因。

我们当地的眼内炎临床实践指南包括经验性方案：眼内注射头孢他啶、万古霉素和地塞米松，若怀疑真菌来源则省略地塞米松，目标是在患者就诊后1小时内给药。这两种抗生素表现出时间依赖性的杀菌活性。本研究未比较聚合酶链反应（PCR）检测的微生物学结果，因为我们的临床实验室不常规进行此项检测。然而，Sauer等人报告，通过PCR，细菌检测率从50%上升到90%，且具有良好的敏感性和相对快速的结果可用性。

我们承认，本研究未对混杂因素（如患者合并症、免疫状态、种族以及干预间隔时间）进行调整，这可能是一个局限性。我们意识到患者合并症和免疫状态可能存在报告不足的情况。作者意识到我们的研究人群可能排除了一些初始玻璃体或房水穿刺在其他机构进行的患者。此外，在第二次穿刺前因病情非常严重导致眼球摘除的病例也被排除，这也可能导致对真实培养阳性率的低估。

总之，基于这些发现，我们的临床建议是：前房穿刺在增加初始活检时的培养阳性率方面具有价值；对于初始培养阴性的患者，第二次取样是有益的，但当第一次活检已经培养阳性时，其价值有限；手术标本对总体培养产出有重要意义；第二次样本之后培养房水不能提供额外的诊断益处。