秀丽隐杆线虫滞育期年龄减速与逆转的基因表达模式解析

《Aging Cell》：Age Deceleration and Reversal Gene Patterns in Dauer Diapause

本文系统研究了秀丽隐杆线虫（C. elegans）dauer滞育阶段及其退出过程中的年龄减速与逆转机制。通过应用BiT Age转录组衰老时钟，作者发现dauer阶段生物年龄增长减速，而在dauer退出后出现年龄逆转。研究揭示了代谢重编程、蛋白质稳态（包括自噬和蛋白酶体活性）以及DNA损伤修复（特别是转录偶联核苷酸切除修复TC-NER）在延缓衰老和实现 rejuvenation 中的关键作用。这项工作为理解自然发生的衰老干预和 rejuvenation 机制提供了重要见解。

　　

ABSTRACT

衰老过程以生理功能普遍下降为特征，是癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等多种疾病的最大风险因素。理解自然进化中延缓衰老和使动物恢复年轻的机制，可以揭示如何预防年龄相关疾病甚至逆转衰老的重要概念。秀丽隐杆线虫的dauer阶段是一个强健且长寿的替代发育状态，在dauer退出后，其成年寿命正常且完全保留繁殖能力。为了理解dauer期间的长寿和dauer退出后的 rejuvenation 是如何介导的，我们表征了dauer期间和退出时的基因表达变化。我们评估了dauer期间和退出后，通过转录组衰老时钟BiT Age确定的生物年龄如何受到影响。在dauer阶段，我们测量到与 chronological age 相比，年龄增长减速，并且在dauer退出后出现年龄逆转。转录组分析揭示了主要的代谢转变和增强的生物分子降解，这些在退出过程中被逆转。此外，我们表明，转录阻断损伤可以诱导dauer中持久的转录应激，这种应激在dauer退出期间通过转录偶联核苷酸切除修复（TC-NER）迅速解决。我们的数据为自然发生的年龄减速和 rejuvenation 的潜在机制提供了新的见解。

1 Introduction

衰老过程贯穿生命始终，增加了年龄相关疾病和死亡的风险。一些物种在衰老速率和 consequently 寿命方面表现出非凡的可塑性。秀丽隐杆线虫因其寿命具有很大程度的可塑性而成为衰老研究的重要模型，这部分是由保守机制（如胰岛素样生长因子-1受体同源物DAF-2）遗传控制的。在不利条件下，如过度拥挤、食物短缺或热应激，秀丽隐杆线虫可以在其发育过程中进入所谓的dauer滞育状态。这种停滞发生在动物在第一幼虫阶段（L1）遇到此类条件时，随后它们经历一个替代的第二幼虫阶段（L2d），停滞在一个替代的第三幼虫形态（L3 dauer）。dauer滞育动物会停滞很长时间，直到条件改善，通过L4阶段退出dauer，成为有繁殖能力的成虫。这种发育调控的过程是在不利条件下的一种生存策略，在此期间代谢通常受到抑制。该线虫有几种滞育状态，其中dauer状态是最强健和最长寿的一种。在秀丽隐杆线虫中，大多数细胞分裂发生在早期胚胎发育过程中，在最早的幼虫阶段，大多数体细胞已经分化，并在随后的发育生长中仅扩大尺寸。在dauer中，体细胞完全处于分裂后期，因此需要分化细胞的 rejuvenation，而被停滞的生殖细胞在恢复为成虫时再生生殖系。在滞育状态期间获得的与衰老和衰老相关的分子变化在很大程度上在滞育退出时被逆转。虽然关于滞育后适应性的报告各不相同，但与未中断发育的动物相比，成年寿命并未减少。然而，长的dauer持续时间降低了成功恢复发育的机会，其中繁殖力是变化最大的特征。

在过去十年中，已经开发出衰老时钟来测量器官、生物体甚至整个类群的生物年龄。大多数衰老时钟依赖于表观遗传标记，特别是年龄依赖的CpG甲基化变化。然而，秀丽隐杆线虫缺乏甲基化的CpG位点。转录组数据反映了表观遗传修饰和染色质结构变化的汇聚，使其成为构建年龄相关变化预测因子的有用读数。因此，基于转录组的衰老时钟，如二值化转录组（BiT）年龄时钟，可以在秀丽隐杆线虫中提供高度准确的生物年龄预测。

在本研究中，我们旨在揭示秀丽隐杆线虫在dauer滞育期间及其退出时所采用的长寿和 rejuvenation 机制。我们首先进行了实验以确定在我们的实验设置中滞育后的适应性。我们观察到，经历dauer的线虫没有表现出发育延迟、寿命缩短或繁殖力变化，无论dauer持续时间如何。通过应用BiT Age基于转录组的衰老时钟，我们预测在dauer滞育期间衰老速率减慢，并在dauer退出时出现年龄逆转。我们剖析了dauer衰老过程中没有表型年龄相关退化的衰老过程的基因表达程序，然后表征了dauer退出期间发生的 rejuvenation 程序的转录组基础。我们确定了滞育期间代谢过程和蛋白质稳态机制的转变，这些在退出时被逆转。然后我们表明，DNA损伤可以诱导持久的转录应激，通过基因长度依赖性转录下降（GLTD）评估，这已在多个物种的衰老过程中观察到。在dauer退出期间，转录偶联核苷酸切除修复（TC-NER）迅速恢复转录完整性，表明基因组稳定性得到恢复。我们的数据为了解没有病理学的缓慢滞育衰老和自然发生的 rejuvenation 过程提供了见解，这可能指导 geroprotective 和 rejuvenating 干预策略。

2 Results

2.1 Influence of Dauer Arrest on Post-Dauer Health

由于关于dauer停滞对滞育后健康和适应性影响的报告各不相同，我们首先进行了寿命、繁殖力和发育测定，以评估dauer滞育对我们实验设置中滞育后适应性的影响。我们选择使用秀丽隐杆线虫的dauer组成型（Daf-c）突变株系daf-2(e1370)来实现高效率和同步化的dauer进入。通过在25°C下培养同步化的daf-2(e1370) L1幼虫群体来诱导dauer进入。在这些条件下，动物以高度同步的方式进入dauer滞育。在25°C下72小时后，所有线虫都建立了dauer停滞，我们称它们为第1天dauer（D1）。通过将动物转移到新鲜接种大肠杆菌作为食物源的平板上，并将培养温度切换到15°C来诱导dauer恢复，导致dauer退出并通过L4阶段恢复发育进入成虫期。

我们进行了一项发育测定，评估了停滞在dauer中1、10、20或30天的群体的dauer恢复动态。我们观察到，在dauer中维持较长时间的群体没有延迟，大多数线虫在诱导dauer恢复后96小时达到年轻成虫阶段。我们还评估了正常发育的野生型（WT）动物、未停滞在dauer中的daf-2突变动物（在发育期间保持在15°C）以及停滞在dauer中1、10或20天的动物的寿命和繁殖力。正如先前报道的，daf-2突变体表现出延长的寿命但繁殖力与WT相比减少。重要的是，我们检测到停滞在dauer中不同持续时间的成年蠕虫群体与未经历dauer的daf-2蠕虫在寿命或繁殖力上没有差异。

总的来说，这些结果表明，尽管经历dauer的线虫具有更高的 chronological age，但在滞育后线虫中没有发生持久的功能衰退。这些结果与先前的报告一致，表明尽管在滞育期间出现某些年龄相关的分子变化，但它们在恢复时在很大程度上被逆转，从而维持了滞育后的健康和生殖能力。

2.2 Predicted Biological Age During Dauer Arrest and Upon Recovery

dauer滞育体现了寿命可塑性：即使它们可以比正常发育的动物存活多倍时间，一旦从dauer恢复，尽管其 chronological age 较大，它们显示出正常的成年寿命。这，连同先前关于秀丽隐杆线虫滞育衰老过程中分子变化的报告，表明衰老在滞育期间减慢并在退出期间逆转。

为了研究这一假设，我们设计了一个实验设置，收集了停滞在dauer中1、4、15或30天的秀丽隐杆线虫群体，以及经历dauer退出的群体（退出诱导后6小时和24小时），并进行了批量RNA测序。由于线虫在退出后6小时和24小时仍在积极地从dauer恢复，我们假设调控转录程序将在这些早期恢复阶段被积极调动。我们选择6小时和24小时时间点，因为它们对应于动物在形态上仍然是dauer或刚刚开始退出的过渡状态。这使我们能够专注于与从休眠状态退出的最早变化， prior to 过渡到随后的滞育后发育阶段。我们另外包括L3幼虫样本作为非dauer对照组，因为dauer代表在不利条件下取代L3阶段的替代发育轨迹。

我们首先进行了主成分分析（PCA），以识别样本间的主要变异来源，并在低维空间中可视化样本聚类。dauer停滞样本主要沿着PC1按其各自的 chronological age 排列，表明在dauer状态期间存在渐进性变化。在dauer退出时，大多数样本向L3对照样本的方向移动。这种移动在D4 dauer退出样本中最为明显，其中退出后6小时和24小时时间点都显示出与L3最大的接近度。D15和D30退出样本也向L3移动，但程度较小，表明与D4退出相比，转录组恢复轨迹不太完全。相比之下，D1 dauer退出样本显示出不同的轨迹，沿着PC2更接近L3，但沿着PC1略有偏离。前两个主成分的载荷显示，与PC1正富集相关的KEGG通路主要与核糖体生物发生、自噬和长寿信号传导有关。PC1中负富集的通路与代谢和溶酶体功能有关。PC2在核糖体功能、氧化磷酸化/代谢和溶酶体方面具有正富集，没有任何负富集通路。PCA中显示的动态表明，dauer持续时间影响转录组恢复的速率，较短的持续时间能够实现更快的转录组恢复，这与先前对L1滞育退出的观察一致。因此，PCA表明了一个渐进的dauer衰老轨迹和一个依赖于滞育持续时间的 rejuvenation 轨迹。

接下来，我们使用我们先前建立的BiT Age基于转录组的衰老时钟估算了秀丽隐杆线虫在dauer停滞期间和恢复后的生物年龄。BiT Age使用一种二值化方法，通过将表达值转换为二进制状态（0或1），取决于该值是否超过每个样本中的中位数表达值。这种二值化减少了阻碍先前转录组时钟准确性的基因表达水平变异。此外，BiT Age时钟被训练为确定生物年龄，因为所有训练数据集的寿命数据都是已知的，因此允许将 chronological age 按时间重新调整为生物年龄（即，相对于中位生存时间的年龄）。我们先前表明，BiT Age时钟在成年早期就能提供高度准确的寿命预测，从而反映了生物年龄。

尽管BiT Age时钟是在成年秀丽隐杆线虫的转录组数据上训练的，但它指示了按 chronological age 衰老的dauer停滞动物的预测生物年龄（PBA）进展。PBA从D1增加到D30，在D4和D15之间有一个暂时的平台期，表明存在非线性衰老轨迹。生物衰老的速率随时间逐渐减慢：例如，在D1时，PBA是123小时，而在D4时是180小时。这对应于在72小时的 chronological time span 内，生物年龄差异为57小时。因此，这两个时间点之间的生物衰老速率约为0.79（57小时/72小时）。由于在D30时，PBA是256小时，D4和D30之间的生物衰老速率约为0.12（76小时/624小时）。这些结果表明，尽管生物衰老在dauer状态期间持续，但衰老速率随时间急剧下降。

此外，D15时退出后24小时的PBA比D30时退出后24小时的PBA更年轻，表明较老的dauer需要更多时间来逆转在滞育期间积累的年龄相关变化。为了独立评估dauer幼虫的PBA，我们应用了我们的基于随机数据的时钟，该时钟模拟了随时间积累的随机变化，并且对成年特异性通路或调控程序不可知。尽管在概念上与BiT Age不同，这个时钟同样揭示了dauer退出后的 rejuvenation 模式。为了进一步验证这些结果，我们分析了一个先前发表的野生型dauer退出时间序列数据集，并再次观察到dauer退出后PBA的降低。尽管观察到较老dauer的转录组恢复延迟，但我们的发育测定结果表明，它们在发育dauer退出程序的表型后果方面没有受到影响。这表明较长的滞育持续时间延迟了分子恢复，但并未损害dauer恢复的发育控制。

为了将这些发现置于背景中，我们还预测了L3幼虫的生物年龄。L3样本显示出显著低于dauer或退出后24小时动物的PBA。来自多个公共数据集的发育时间进程数据证实，我们的L3样本与整个L3阶段的PBA估计值非常吻合。虽然秀丽隐杆线虫的发育以振荡基因表达动力学为特征，但我们仍然在L3期间观察到PBA的适度上升趋势。相比之下，dauer幼虫中的转录程序是非振荡的，可能允许更清晰地测量年龄相关变化。

总之，PCA和衰老时钟分析表明，dauer停滞伴随着渐进的转录组衰老轨迹。退出时，dauer样本在转录上向L3幼虫状态移动，其恢复动力学受先前停滞持续时间的影响。虽然PCA显示了全局表达模式的变化，但BiT Age和基于随机数据的时钟独立地证实了dauer退出后生物年龄下降，支持了一个 rejuvenation 过程。这些结果表明，尽管转录组恢复和生物年龄逆转并不完全一致，但它们代表了dauer退出反应的互补方面。有趣的是，第一个PC与Bit Age预测强烈相关（Pearson相关性：0.91，p值：4.4e-16）。PC2与Bit Age显示出较弱的相关性（所有样本的Pearson相关性：-0.15，p值：0.36；排除L3的Pearson相关性：0.39，p值：0.02）。总之，这些互补的方法提供了证据，表明dauer退出需要协调逆转转录组和生物衰老特征，主要变异轴（PC1）密切反映了生物年龄轨迹。

2.3 Transcriptomic Patterns Throughout Dauer Arrest and During Recovery

我们接下来试图表征dauer衰老和退出过程中的基因表达动力学。我们没有使用多个成对比较，而是使用一种统计方法，模拟每个基因的表达在 chronological time 上的轨迹。这使我们能够评估一个基因的表达是否在连续时间点上增加或减少，从而揭示更广泛的调控趋势。我们专注于（1）dauer衰老：从D1到D30的dauer阶段基因表达的变化，和（2）dauer退出：从诱导dauer退出后的前6小时到24小时基因表达的变化。对于每个基因，我们使用线性模型计算一个斜率，该斜率量化了dauer衰老和dauer退出过程中随时间变化的方向（上调和下调）和速率。具有正斜率的基因在时间过程中表达增加，而具有负斜率的基因表达减少。然后，我们将具有统计学显著斜率的基因（例如，在时间过程中表达持续增加）识别为差异表达基因（DEG），并进行了KEGG通路富集分析以检测生物通路中的模式。

2.4 Dauer Aging

在dauer衰老期间，24条通路显著下调，而只有5条通路显著上调。多条代谢通路下调，这与dauer状态非活跃的低代谢、抗应激性质一致。鉴于代谢活动减弱具有延长寿命的效果，这种代谢下调与BiT Age预测的dauer状态期间生物衰老速率减慢一致。相反，长寿调控通路、蛋白酶体和自噬在dauer衰老期间显著上调。这表明dauer幼虫可能调动增强的蛋白质质量控制和细胞维护机制，这有助于减轻损伤积累，并可能有助于其延长生存期。

为了表征超出线性变化的表达动力学，我们根据它们的dauer衰老依赖性表达谱将所有基因聚类为四组。虽然线性模型分析识别了一般的方向性趋势，但聚类揭示了在dauer时间过程中具有非线性动力学的不同共调控基因集。最大的簇（第1组）显示出明显的下调，并富集于代谢通路，如谷胱甘肽、碳和脂肪酸代谢。这反映了初始通路分析中观察到的代谢下降，并进一步表明广泛的代谢下调是dauer衰老的一个主要特征。

第2组显示一致的上调，并显著富集于蛋白质稳态相关通路，包括蛋白酶体和自噬。这表明，虽然dauer幼虫减少了整体代谢活动，但它们同时增强了蛋白质稳态机制，可能作为一种在能量限制条件下延长寿命的适应性策略。

第3组显示一个瞬时的、非线性的增加，在第4天达到峰值，并富集于DNA复制和DNA修复通路，包括核苷酸切除修复、碱基切除修复、错配修复和同源重组，表明基因组维护的广泛增加。时间安排表明，dauer幼虫可能在停滞早期短暂提升DNA修复能力，可能作为一种启动反应，以在 prolonged quiescence 期间保持基因组完整性。

第4组在第15天有一个中间的上调，并富集于核糖体，表明为dauer退出准备了翻译机器。

2.5 Dauer Exit

接下来，我们专注于表征转录组dauer退出动力学。为了评估dauer退出对转录组反应的重叠程度 across 不同的dauer衰老时间点，我们比较了在D1、D4、D15和D30使用与之前相同的线性模型方法识别的DEG集合。在这里，DEG被定义为在dauer内、退出后6小时和退出后24小时样本中表达发生显著变化（即斜率显著不同于0）的基因。总体而言，这些DEG集合显示出高度的相似性，表明与dauer退出程序相关的核心过程。D1退出显示出最独特的退出模式，并且与其他时间点的重叠最低，而D15和D30显示出最高的相似性。这些观察结果与PCA中观察到的退出轨迹一致，其中D1样本最显著地偏离其他天数。

为了研究dauer退出的转录反应如何依赖于滞育的持续时间，我们对在dauer停滞第1、4、15和30天恢复的动物，跨dauer退出时间点的差异表达基因进行了KEGG通路富集分析。KEGG富集分析表明，dauer退出通常与溶酶体和多条代谢通路的上调相关，这与代谢抑制的dauer状态后能量需求过程的重新激活一致。这与在dauer状态期间观察到的代谢活动减少形成对比，并表明退出时代谢功能被重新激活。然而，退出期间富集的具体生物通路因dauer持续时间而异。这可能是由于线虫在dauer状态期间累积的变化。此外，在D1和D15下调基因中富集长寿相关基因，可以解释为dauer长寿机制的结束和正常生命周期的恢复。

其中最显著动态的通路之一是蛋白酶体。蛋白酶体基因在dauer衰老期间强烈上调，表明在 prolonged diapause 期间蛋白质稳态的适应性上调。然而，在dauer退出时，这一轨迹被逆转，蛋白酶体基因表达显示出时间依赖性模式：蛋白酶体基因在早期（D1）dauer退出时富集于上调基因中，到D4时不再显著富集，而在后期阶段（D15和D30）退出的动物中，反而富集于下调基因中。在退出后24小时时间点，蛋白酶体表达在D1退出动物中最高，在D30退出动物中最低——与dauer衰老本身看到的表达模式相反，表明滞育持续时间与恢复期间动态调节蛋白酶体活性的能力之间存在相互作用。这些数据表明，早期dauer退出，在滞育期间尚未强烈上调蛋白酶体基因，需要在退出时进行额外的转录上调以恢复蛋白质稳态。相比之下，长期dauer已经上调了它们的蛋白酶体能力，使得在恢复期间能够正常化甚至下调。

我们的发现表明：（1）蛋白质合成和降解通路（包括溶酶体和蛋白酶体活性）之间的相互作用是dauer长寿程序的一部分，可能与可变剪接调控相结合；（2）驱动dauer恢复期间 rejuvenation 的转录组程序涉及蛋白酶体动力学和代谢过程的上调。

2.6 Effects of UV-Irradiation on Dauer Recovery and Gene Length-Dependent Transcription Patterns

基因组的维护是长寿的重要组成部分，而基因组稳定性如何在 rejuvenation 过程中恢复仍不清楚。因此，我们研究了dauer幼虫如何维持基因组完整性并从DNA损伤中恢复。dauer幼虫的一个特别显著特征是它们对各种应激的抵抗力，包括UV诱导的DNA损伤。为了探索它们维持基因组的能力，我们使用UV作为诱导转录阻断DNA损伤的基因毒性范例，这在衰老过程中，特别是在诸如神经元等分裂后期细胞类型中起着特别重要的作用。我们选择UVB处理，因为它主要诱导明确定义的环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）。CPDs扭曲螺旋结构，导致转录延伸停滞，直到通过转录偶联核苷酸切除修复（TC-NER）进行修复。通过干扰转录延伸，这种损伤类型对非分裂细胞类型（如组成dauer的细胞）特别相关。因此，我们在滞育开始时将线虫暴露于UV辐射，并评估取决于dauer持续时间的恢复动力学。

首先，我们照射D1线虫，并诱导dauer恢复，要么直接进行，要么将照射过的动物留到D4再触发退出。随着UV剂量的增加，dauer的恢复被延迟，表明在退出过程中，DNA修复需要时间来清除损伤。然而，我们观察到，当动物被给予额外的4天dauer时间来从UV诱导的损伤中恢复时，这种延迟只有非常微小的减少。这表明，dauer退出所需的基因中UV诱导损伤的修复主要发生在退出触发之后，而不是在dauer阶段本身。为了确定尽管在dauer中没有表型后果，但应用的UV辐射具有生物学后果并且需要修复UV诱导的DNA损伤，我们接下来测试了干扰核苷酸切除修复（NER）通路的影响。NER是去除螺旋扭曲损伤（如UV诱导的CPDs）的主要机制。当RNAPII在损伤处停滞时，CSB-1蛋白诱导转录偶联（TC-）NER。在整个基因组中，此类损伤被XPC-1识别，它启动全局基因组（GG-）NER。两者都通过招募XPA-1汇聚到NER核心通路上。在UV照射下，csb-1突变体导致发育生长延迟和线虫分裂后期体细胞中的 premature aging（因为它们需要转录但不需要DNA复制），而xpc-1突变体在增殖性生殖细胞中对UV敏感。xpa-1突变体在所有细胞类型中对UV都极度敏感，因为不存在NER活性。这些线虫表型反映了人类疾病综合征，其中由CSB突变引起的TC-NER缺陷导致生长延迟和 premature aging，而由XPC突变引起的GG-NER缺陷导致增殖细胞整个基因组中突变升高，导致极度皮肤癌易感性。

鉴于NER在DNA损伤驱动的衰老中的作用，我们通过跟踪NER突变体的dauer恢复来测试扰乱的NER通路对dauer退出的后果。所有NER突变体在没有UV诱导DNA损伤的情况下，其恢复动力学与单一daf-2突变体相似。然而，在UV暴露后，我们观察到恢复发育的延迟是剂量和NER依赖性的。完全NER缺陷的daf-2;xpa-1突变体即使在最低剂量15 mJ/cm²下也无法恢复发育。TC-NER缺陷的daf-2;csb-1突变体表现出dauer退出的短暂延迟，而在30 mJ/cm²下，大多数TC-NER缺陷动物无法恢复发育。相比之下，GG-NER缺陷的daf-2;xpc-1突变体显示出与daf-2单突变体相似的UV敏感性。这些结果与TC-NER在体细胞中的作用高度一致，体细胞在胚胎发育后大多处于分裂后期。

为了进一步解决dauer期间的NER活性，我们使用一种已建立的抗CPD抗体，该抗体特异性识别这种损伤类型，通过斑点印迹评估UV诱导的CPDs的去除。dauer中的CPD去除动力学与非dauer L3幼虫几乎一样有效，在最初24小时内修复了超过50%的UV诱导损伤，随后是较慢的修复，这与先前表明双相修复动力学的报告一致。鉴于D1和D4 dauer在D1照射后表现出相似的恢复动力学，尽管D4 dauer在退出前有额外的dauer时间，这表明虽然全局修复机制在dauer期间保持活跃，但退出所需的转录相关区域的修复可能主要发生在退出 initiation 期间，而不是在dauer本身。这与TC-NER在修复活跃转录区域中的作用一致，并可能解释为什么TC-NER缺陷动物在UV暴露后表现出恢复的短暂延迟。

虽然CPD定量评估了整个基因组的总体DNA损伤负担，但CPDs对阻断转录的影响仅限于发生在活跃转录链上的那些，导致RNAPII停滞。转录阻断DNA损伤的影响可以通过长开放阅读框编码的基因表达减少来评估。在这里，UV损伤导致基因长度依赖性转录下降（GLTD），指示转录应激。类似于转录阻断UV诱导损伤的效果，GLTD在多个物种的衰老过程中被观察到。据认为，GLTD是由衰老过程中转录阻断损伤的积累触发的。因此，研究dauer退出期间基因长度依赖性表达的变化可以进一步阐明导致年龄相关GLTD的转录阻断DNA损伤的逆转。我们评估了D1-UV处理的动物在D4时和在第4天dauer退出时的基因表达变化。在dauer中，UV处理样本中相对于未处理样本的下调基因比上调基因更长，指示即使在UV处理后4天也存在DNA损伤诱导的GLTD。在dauer恢复期间（6小时，24小时），UV照射和对照样本之间的转录组差异 largely normalize。只有少数基因仍然差异表达，并且这些基因在上调和下调基因之间没有显示任何长度差异，表明转录偶联修复有效地恢复了转录输出并成功改善了GLTD。

总的来说，这些结果强调了dauer幼虫承受和从基因毒性应激中恢复的显著能力，突出了NER，特别是TC-NER，在促进成功dauer退出中的重要性。此外，观察到的从UV诱导的GLTD中恢复表明，dauer退出过程触发了转录阻断损伤的去除并恢复了转录完整性，使得退出后能够有效重新激活生物过程。总之，我们的数据揭示了dauer滞育和恢复期间基因组维护、应激抵抗和转录重新激活之间的 robust interplay。

3 Discussion

理解自然发生的减缓衰老和 rejuvenation 的潜在机制，可以揭示保存和恢复衰老生物体功能完整性的有效范例。秀丽隐杆线虫滞育是寿命可塑性的一个特别显著的例子，因为尽管其 chronological age 可能比正常寿命长多倍，但它恢复后追求不变的成年寿命和完全的生殖能力。dauer的体细胞已经完全处于分裂后期，因此需要在滞育阶段保存其功能完整性，并在退出时无需细胞更新即可实现 rejuvenation。在这里，我们利用秀丽隐杆线虫dauer滞育和dauer退出作为模型，探索年龄减速和 rejuvenation 的生理机制。

我们确定了在daf-2突变体中，dauer滞育对滞育后寿命、繁殖力和发育没有负面影响。我们产生了一个批量RNA-seq数据集，包括滞育和恢复期间的多个时间点，以表征它们的转录组模式。使用BiT Age转录组时钟，我们证明预测的生物年龄在dauer停滞期间增加，并在退出诱导后减少。虽然BiT Age最初是在成年转录组上训练的，但我们在这里将其应用于dauer幼虫和dauer退出样本，以评估沿着共同衰老轨迹的相对转录组变化。重要的是，我们对这些幼虫阶段生物年龄的解释是比较性的而非绝对的。预测年龄随dauer持续时间的持续增加表明，BiT Age即使在生命早期阶段也能捕获相关的年龄相关转录特征。衰老速率从滞育头3天的每单位 chronological time 0.8单位生物时间，变为从D4到D30的0.1，表明在滞育停滞的最初几天达到了衰老平台期。在dauer退出时，生物年龄显著降低，因为恢复的dauer显示出与按 chronological age 更年轻但经历正常幼虫发育的动物相同的寿命和繁殖力。这反映在预测生物年龄的逆转上。虽然这种逆转在滞育4天后24小时最为明显，但更长的滞育期导致预测年龄的重置较慢，在退出诱导后的头6小时内变化可忽略不计。这似乎与dauer滞育持续时间越长，dauer退出时间普遍增加有关。这种类似 rejuvenation 的生物年龄逆转得到了一个概念上不同的基于随机数据的衰老时钟的独立支持，该时钟模拟了随时间积累的随机转录变异。尽管它独立于特定的调控程序或成年训练数据，这个时钟同样揭示了dauer退出后生物年龄的减少，加强了观察到的分子 rejuvenation 的稳健性。

秀丽隐杆线虫dauer退出 rejuvenation 模型不会导致分裂后期