基质刚度通过DRP1介导的线粒体分裂诱导肌成纤维细胞衰老促进矽肺纤维化

《Aging Cell》：Matrix Stiffness Promotes DRP1-Mediated Myofibroblast Senescence to Drive Silica-Induced Pulmonary Fibrosis

本研究发现，在矽肺纤维化进程中，细胞外基质（ECM）刚度增加通过上调线粒体分裂蛋白DRP1，诱导线粒体活性氧（mtROS）积累和DNA损伤，最终导致肌成纤维细胞衰老。衰老肌成纤维细胞通过旁分泌作用进一步促进成纤维细胞活化和胶原沉积，形成恶性循环。靶向线粒体抗氧化剂MitoQ10可有效缓解这一过程，为抗纤维化治疗提供了新策略。

　　

1 引言

随着工业化进程的加速，职业性肺病已成为全球日益关注的健康问题。其中，二氧化硅诱导的肺纤维化尤为严重，其特征是矽结节形成和由持续性成纤维细胞活化及过度细胞外基质（ECM）沉积驱动的弥漫性纤维化。尽管病因明确，但由于疾病涉及复杂的多细胞相互作用，目前仍缺乏有效的治疗方法。

近年来，组织微环境的生物物理特性——特别是基质刚度——如何调节组织稳态和病理重塑受到越来越多的关注。作为基本的机械信号，基质刚度深刻影响细胞迁移、增殖、分化和代谢等关键行为，从而塑造生理过程和疾病进展。在纤维化疾病中，进行性的基质硬化源于活化成纤维细胞过度沉积ECM蛋白（主要是胶原蛋白、纤连蛋白和透明质酸）。这种硬化的基质反过来通过正向机械信号环路强化成纤维细胞活化，维持肌成纤维细胞表型，并持续推动病理重塑。肌成纤维细胞作为纤维化的主要效应细胞，同时具有成纤维细胞和平滑肌细胞的特征，包括表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、形成显著的应力纤维和增强的收缩性。虽然短暂的肌成纤维细胞活化对组织修复至关重要，但持续的机械应力驱动其持续活化和积累，导致过度的ECM沉积、瘢痕形成和进一步的基质硬化。更重要的是，硬化基质产生的机械信号通过正反馈环路增强肌成纤维细胞的促纤维化活性，加剧纤维化。尽管这一认识日益加深，但基质硬化如何驱动肌成纤维细胞的功能转变——特别是在矽肺纤维化中——仍知之甚少。

细胞衰老是一种由DNA损伤、癌基因激活、氧化应激或端粒缩短触发的不可逆细胞周期停滞，主要由p53/p21和p16^INK4a/pRb肿瘤抑制通路介导。越来越多的证据凸显了其在纤维化肺病中的关键作用。衰老细胞在特发性肺纤维化（IPF）和博来霉素诱导的纤维化中均有贡献。值得注意的是，在肺纤维化患者的纤维化肺组织中积累了衰老的肌成纤维细胞。类似地，有报道称在纤维化高峰期清除衰老的肌成纤维细胞可以缓解症状并阻止疾病进展，表明肌成纤维细胞衰老是纤维化的关键驱动因素。除了损伤诱导的触发因素外，基质硬化也与衰老有关。研究发现ECM硬化是血管老化的标志。同样，基质硬化加速软骨细胞和软骨衰老，促进骨关节炎，并在博来霉素诱导的肺纤维化中驱动上皮细胞衰老。然而，基质硬化是否在矽肺中诱导肌成纤维细胞衰老仍有待探索。理解基质硬化如何与衰老在矽肺纤维化中相互作用，对于阐明其在疾病发病机制中的作用至关重要。

线粒体是细胞代谢、活性氧（ROS）产生和应激反应的核心调节器，其功能障碍已被证明与纤维化和细胞衰老密切相关。动力相关蛋白1（DRP1）是线粒体分裂的关键调节因子，在维持线粒体动力学和稳态中起关键作用。既往研究报道，DRP1的过度激活常伴随线粒体形态异常和线粒体活性氧（mtROS）的积累，这种氧化应激状态可能进一步影响细胞功能和命运。因此，聚焦于DRP1和线粒体氧化应激的研究逐渐成为理解细胞衰老和纤维化病理过程的重要途径。

本研究旨在系统探讨基质硬化是否通过促进肌成纤维细胞衰老而加剧矽肺纤维化进程。为此，我们建立了使用不同刚度脱细胞肺基质的体外培养模型，并利用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ10进行功能干预。通过这种方法，我们试图阐明基质刚度、细胞衰老和纤维化进展之间的内在联系，并揭示其潜在机制。我们的发现可能为矽肺的发病机制提供新的机理见解，并为干预肺纤维化确定潜在的治疗靶点。

2 材料与方法

2.1 动物与实验设计

将18只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、矽肺4周组和矽肺8周组。通过气管内滴注二氧化硅悬浊液建立矽肺模型，对照组滴注无菌生理盐水。在滴注后第4周和第8周处死小鼠，收集肺组织进行分析。

2.2 细胞培养

从新生C57BL/6J小鼠肺组织中分离原代肺成纤维细胞。使用NIH/3T3细胞系作为补充。为诱导肌成纤维细胞分化，用5 ng/mL TGF-β1处理细胞24小时。

2.3 扫描电子显微镜（SEM）

观察冻干后的脱细胞肺基质的超微结构。

2.4 脱细胞肺基质的制备与切片

根据既定方案，从对照组、4周矽肺组和8周矽肺组小鼠制备脱细胞肺基质。将所得基质分类为低（对照）、中（4周矽肺）和高（8周矽肺）刚度组。

2.5 原子力显微镜（AFM）

测量脱细胞肺基质切片的弹性模量，量化基质刚度。

2.6 组织学分析

对石蜡包埋的肺组织切片进行H&E和Masson三色染色，评估炎症浸润和胶原沉积。

2.7 基质切片培养系统

将细胞接种于脱细胞肺基质冰冻切片表面进行培养。为研究mtROS的作用，在细胞融合度达70%–80%时用50 nM MitoQ10处理2小时，然后更换新鲜培养基继续培养24小时。

2.8 原代成纤维细胞的条件培养基处理

收集在基质切片上培养48小时的肌成纤维细胞上清液，过滤后作为条件培养基处理原代成纤维细胞24小时。

2.9 免疫荧光染色

检测α-SMA、Ki67、p53、p21、p16、DRP1、细胞色素c、γ-H2A.X和磷酸化Rb等蛋白的表达和定位。

2.10 mtROS测量

使用MitoSOX Red荧光探针检测线粒体超氧化物水平。

2.11 p16-3MR小鼠体内肺成像

利用p16-3MR转基因衰老报告小鼠，通过活体成像检测肺组织中的衰老细胞。

2.12 原代成纤维细胞的流式细胞术鉴定

通过流式细胞术分析细胞表面标志物（CD31、CD45、CD326、LYVE1）来鉴定原代成纤维细胞。

2.13 衰老肌成纤维细胞的荧光激活细胞分选（FACS）

从矽肺模型p16-3MR小鼠肺组织制备单细胞悬液，通过流式细胞分选术分离CD31^?CD45^?CD326^?LYVE1^?CD90^? mRFP⁺的衰老肌成纤维细胞。

2.14 衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色

检测细胞衰老状态。

2.15 定量实时PCR（qRT-PCR）

检测Acta2、Col1a1和Fn1等基因的mRNA表达水平。

2.16 蛋白质印迹分析

检测胶原蛋白I、α-SMA、纤连蛋白等蛋白的表达水平。

2.17 统计分析

使用SPSS软件进行统计分析，数据以均值±标准差表示。

3 结果

3.1 矽肺诱导的肺纤维化过程中发生基质硬化

成功建立小鼠矽肺模型，H&E和Masson染色显示随二氧化硅暴露时间延长，肺泡结构破坏加剧，胶原沉积显著增加。蛋白质印迹证实胶原蛋白I、纤连蛋白和α-SMA蛋白水平在矽肺组显著上调，且8周组高于4周组。脱细胞肺基质的扫描电镜显示，矽肺组基质结构更致密、纤维排列紊乱。原子力显微镜测量显示，脱细胞肺基质的弹性模量随矽肺进展而显著增加，表明基质刚度进行性升高。

3.2 高基质刚度促进成纤维细胞增殖和活化

将NIH/3T3细胞和原代肺成纤维细胞培养在不同刚度的脱细胞基质上。结果显示，随着基质刚度增加，成纤维细胞增殖（Ki67阳性率）和活化（α-SMA表达）均显著增强。原代肺成纤维细胞对机械信号更敏感，在高刚度基质上表现出更明显的肌成纤维细胞特征。

3.3 高基质刚度诱导肌成纤维细胞衰老

利用p16-3MR衰老报告小鼠进行体内成像，发现矽肺组和D-半乳糖诱导的衰老阳性对照组小鼠肺组织中mRFP信号显著增强，表明衰老细胞积累。流式细胞术进一步在矽肺小鼠肺组织中鉴定出mRFP阳性的衰老肌成纤维细胞。体外实验中，将TGF-β1诱导的肌成纤维细胞培养在不同刚度基质上，发现高刚度基质导致细胞增殖抑制（Ki67减少），而衰老标志物p53、p21、p16、磷酸化Rb表达上调，SA-β-gal阳性细胞增多，证实高基质刚度诱导肌成纤维细胞衰老。

3.4 衰老肌成纤维细胞促进成纤维细胞活化

收集在不同刚度基质上培养的肌成纤维细胞条件培养基，处理原代成纤维细胞。发现高刚度基质来源的条件培养基能显著上调成纤维细胞中Acta2、Col1a1和Fn1的mRNA和蛋白表达水平，表明衰老肌成纤维细胞通过旁分泌作用促进周围成纤维细胞活化和胶原合成。

3.5 高基质刚度通过上调DRP1诱导mtROS产生和DNA损伤

肌成纤维细胞在高刚度基质上培养后，线粒体分裂蛋白DRP1表达上调，伴随细胞色素c从线粒体释放至胞质，表明线粒体膜通透性增加。MitoSOX染色显示mtROS水平显著升高，γ-H2AX焦点形成增加，表明DNA损伤加剧。这些结果提示基质刚度通过DRP1介导的线粒体分裂功能障碍，导致氧化应激和DNA损伤，进而诱发衰老。

3.6 MitoQ10减轻基质刚度诱导的肌成纤维细胞衰老

使用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ10处理肌成纤维细胞，发现其可显著降低高刚度基质诱导的mtROS水平。同时，MitoQ10处理减少了SA-β-gal阳性细胞数，并下调了p21、p16和磷酸化Rb的表达，表明缓解了细胞衰老。这证明靶向线粒体氧化应激是干预刚度诱导衰老的有效策略。

4 讨论

本研究首次系统性地证实了病理性的基质硬化通过DRP1介导的线粒体功能障碍驱动肌成纤维细胞衰老。高刚度基质显著上调DRP1，导致过度的线粒体分裂、细胞色素c释放和mtROS积累，从而引发氧化应激、DNA损伤和细胞周期停滞，最终形成衰老表型。线粒体靶向抗氧化剂MitoQ10能够减轻mtROS并逆转衰老，强调了线粒体功能障碍是连接ECM硬化和肌成纤维细胞衰老的关键机制环节。此外，这些衰老的肌成纤维细胞通过旁分泌信号加剧纤维化，为矽肺的进展提供了新的机械生物学见解。

矽肺传统的特征是持续性和不可逆的肺纤维化。在疾病进程中，吸入的二氧化硅颗粒被肺泡巨噬细胞吞噬，触发促炎细胞因子释放并激活成纤维细胞，导致成纤维细胞增殖、迁移增强和ECM过度沉积，加速纤维化进展。ECM作为一个动态复杂的结构网络，在维持组织结构和稳态中起关键作用，其病理性重塑与纤维化等多种疾病密切相关。

越来越多的证据表明，进行性的ECM积累（尤其是胶原）显著增加了纤维化过程中的基质刚度。与本研究发现一致，机械应力直接促进成纤维细胞活化和肌成纤维细胞分化。作为肺纤维化的主要效应细胞，肌成纤维细胞不仅参与过度的ECM产生，还能动态响应纤维化微环境中的机械信号。通过其收缩力和重塑能力，肌成纤维细胞进一步加剧局部ECM硬化，形成自我强化的纤维化微环境。ECM硬化是组织老化的标志，它破坏机械转导并改变细胞对机械信号的反应，从而恶化衰老相关病理。支持这一概念，本研究表明在二氧化硅诱导的小鼠矽肺模型中ECM刚度进行性增加。重要的是，硬化的基质不仅促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，而且在持续的机械应力下驱动这些细胞进入衰老状态，导致衰老肌成纤维细胞的形成。这一过程很可能由持续机械张力结合炎症微环境触发的应激反应所介导，最终导致细胞周期停滞和衰老程序的启动。

衰老的自由基理论认为过量的ROS导致细胞衰老。其中，mtROS是氧化应激和线粒体功能障碍的主要驱动因素。然而，线粒体动力学，特别是DRP1介导的分裂在衰老中的机制作用仍未充分探索。新出现的证据表明，在某些诱导衰老的条件下线粒体分裂过度激活。DRP1作为线粒体分裂的主要调节因子，协调这一过程。研究发现高基质刚度激活DRP1，驱动线粒体断裂和氧化应激。类似地，在博来霉素诱导的纤维化中，乳酸代谢上调DRP1，促进mtROS积累，而这可被DRP1抑制所缓解。过量的mtROS损伤端粒DNA，激活DNA损伤反应并加速衰老，从而促进纤维化进展。MitoQ10是一种线粒体靶向抗氧化剂，在多种线粒体功能障碍相关病理中显示出治疗潜力。我们的研究证实MitoQ10能降低氧化应激并减轻高刚度条件下的肌成纤维细胞衰老。我们进一步观察到在基质硬化下细胞色素c释放增加，这与DRP1驱动的线粒体通透性增加一致。除了凋亡，亚致死水平的线粒体通透性（miMOMP）促进了线粒体DNA的胞质释放，触发衰老相关分泌表型（SASP）激活并强化衰老表型。总之，我们的发现表明基质刚度驱动DRP1依赖的线粒体断裂，增加mtROS和细胞色素c释放，导致肌成纤维细胞衰老。这凸显了线粒体动力学是连接ECM硬化和衰老驱动的纤维化进展的关键机械生物学转导器。

细胞衰老导致内在功能衰退，还通过分泌炎症和生物活性因子塑造微环境，从而促进肺纤维化的发生和进展。衰老细胞的一个标志是衰老相关分泌表型（SASP），它包括促炎细胞因子、趋化因子、蛋白酶和生长因子。这些分泌因子通过旁分泌信号影响邻近细胞，驱动继发性衰老或激活成纤维细胞和其他基质细胞，从而维持慢性炎症并促进纤维化基质重塑。例如，衰老的肺上皮细胞被证明可促进成纤维细胞活化和胶原产生。具体而言，衰老的肺泡II型（AT2）细胞表现出SASP表达，驱动成纤维细胞增殖并加速纤维化。在慢性纤维化条件下，这种衰老驱动的旁分泌网络很可能是连接机械应力、细胞应激反应和组织结构破坏的关键机制环节。支持这一概念，研究发现机械拉伸诱导肺上皮细胞衰老，进而增强成纤维细胞活化。与这些发现一致，我们的研究表明，来自硬化基质诱导的衰老肌成纤维细胞的条件培养基促进成纤维细胞活化和胶原合成。尽管精确的SASP组成仍有待表征，但这一观察结果表明衰老肌成纤维细胞通过旁分泌信号促进纤维化微环境，进一步放大疾病进展。这一发现为未来研究肌成纤维细胞衰老在纤维化中的旁分泌作用奠定了基础。靶向衰老细胞因此已成为一种有前景的抗纤维化策略。近期研究强调senolytics（senolytics）作为潜在工具，可消除或调节衰老细胞并抑制SASP驱动的信号以减轻纤维化。这些见解为矽肺和纤维化管理提供了新的治疗机会。进一步阐明衰老肌成纤维细胞中SASP的谱系和调控机制将有助于推进靶向抗纤维化干预措施。

本研究的一个关键优势是建立了一个复制纤维化组织机械特性的体外模型。通过将原代肌成纤维细胞培养在具有明确刚度的脱细胞肺基质上，我们成功模拟了病理性的ECM机械环境及其对细胞命运的影响。这种方法增强了生理相关性，并为探索机械应力如何驱动线粒体功能障碍和衰老提供了一个强大的平台。我们也承认一些需要进一步研究的领域，这些领域可以加强我们的发现。虽然我们的结果支持DRP1上调是刚度诱导衰老的核心介质，但我们没有将研究扩展到具有DRP1基因操作的体内模型。这限制了在组织纤维化背景下完全建立因果关系的能力。此外，我们的研究聚焦于DRP1-线粒体分裂通路，但未探索其他机械转导通路，如YAP/TAZ或整合素-FAK，这些通路可能也起关键作用。而且，我们主要研究了ECM刚度，但未解决ECM组成的变化，这些变化可能与机械信号相互作用影响细胞行为。未来结合体内遗传模型和蛋白质组学分析的研究，对于阐明ECM机械和生化特性如何共同塑造肌成纤维细胞在纤维化进展中的行为至关重要。这将有助于更全面地理解纤维化机制，并帮助制定靶向治疗策略。

5 结论

本研究揭示了基质刚度通过mtROS依赖的肌成纤维细胞衰老驱动矽肺相关纤维化。硬化的ECM上调DRP1，促进线粒体分裂，诱导细胞色素c释放和mtROS积累，导致DNA损伤和细胞衰老。衰老的肌成纤维细胞通过旁分泌信号进一步激活邻近成纤维细胞，加剧纤维化。值得注意的是，线粒体靶向抗氧化剂MitoQ10能有效降低氧化应激和衰老，凸显了其治疗潜力。总之，这些发现在基质刚度、线粒体功能障碍和衰老驱动的纤维化之间建立了机制联系。这项工作为在矽肺及相关纤维化疾病中将衰老肌成纤维细胞作为抗纤维化策略提供了一个概念框架。