基于VHH抗CD19 SynNotch受体的配体非依赖性激活评估：双荧光素酶检测揭示动态范围优化关键

《Analytical Science Advances》：Evaluation of the Ligand-Independent Activation of a VHH-Based Anti-CD19 SynNotch Receptor by Dual-Luciferase Assay

本研究创新性采用双荧光素酶检测系统评估VHH基抗CD19 SynNotch受体的配体非依赖性激活（LIA），揭示其高背景活性与24小时延迟响应的特性，为合成受体（SynNotch）的优化设计提供了关键实验依据和高效表征方法。

　　

摘要

配体非依赖性激活（LIA）是限制合成受体动态范围的关键挑战。本研究通过双荧光素酶检测系统评估SynNotch受体的背景活性，该受体采用骆驼源VHH纳米抗体构建抗CD19识别域。结果显示：尽管抗原存在时报告基因表达显著增强，但受体存在高水平背景表达；同时发现SynNotch受体在抗原刺激后需24小时达到峰值激活，撤除抗原后同样需要24小时恢复基线水平，表明受体构造亟需优化以提升动态范围。

引言

随着合成生物学发展，SynNotch受体因其模块化、正交性等特性成为基因电路设计的重要工具。该受体通过抗原结合触发胞内转录因子（TF）释放，进而激活下游基因表达。然而LIA现象普遍存在于合成受体中，传统荧光蛋白检测方法存在耗时费力、成本高昂等局限。本研究创新采用双荧光素酶检测方法，构建抗CD19 SynNotch受体（含GAL4-VP64转录因子），为合成受体表征提供高效可靠的替代方案。

材料与方法

受体构建

SynNotch受体由抗CD19 VHH（源自伊朗基础医学科学研究所报道序列）、小鼠Notch1核心结构域（Ile1427-Arg1752）和GAL4-VP64转录因子构成，N端添加CD8a信号肽（MALPVTALLLPLALLLHAARP）。响应元件为5×GAL4靶序列连接最小CMV启动子，克隆至pGL4.14萤火虫荧光素酶载体。所有构建体经Sanger测序验证。

细胞培养与转染

HEK293T细胞采用高糖DMEM（含10% FBS、1×GlutaMax、青霉素-链霉素）培养，Nalm6细胞使用RPMI培养基。采用PEI转染法，每孔转染1μg混合质粒DNA（含SynNotch编码载体、pGL4.14报告载体、pGL4.74内参载体）。

双荧光素酶检测

转染48小时后使用Promega双荧光素酶检测系统（E1910）进行检测。每孔加入100μL被动裂解缓冲液（PLB），取20μL上清液先后加入LARII缓冲液（检测萤火虫荧光素酶）和Stop & Glo试剂（检测海肾荧光素酶）。

结果

受体功能验证

成功构建的抗CD19 SynNotch受体能特异性识别CD19抗原：抗原结合导致TF释放入核，激活GAL4-UAS驱动的萤火虫荧光素酶表达，而HSV-TK启动子持续表达海肾荧光素酶作为内参。

剂量依赖性LIA现象

转染量实验表明：当SynNotch编码载体转染量达200ng时，CD19+细胞（Nalm6）与CD19-细胞（K562）共培养组出现显著差异（p<0.05），但背景活性随转染量增加而升高。500ng转染组因背景过高未显示显著差异。

抗原剂量响应特性

固定受体表达量下， plate-bound抗原剂量（0-100ng）与报告基因表达呈正相关。计算显示该受体动态范围仅0-100ng，折叠诱导仅1.67（因高背景信号），符合Manhas等提出的初级与集成指标特征。

时间动力学特征

抗原刺激后报告基因表达在20小时达到平台期；撤除抗原后4小时活性急剧下降，24小时恢复基线水平，表明SynNotch存在约24小时的激活/失活延迟。

讨论

双荧光素酶检测相比流式细胞术具有操作简便、成本低廉、避免转染变异等优势。本研究首次在SynNotch抗原结合域应用抗CD19纳米抗体（VHH），其小分子量、低免疫原性特性有助于受体小型化。

高LIA现象与既往研究一致：Yang等研究表明在TF前添加疏水序列（QHGQLWF）可降低背景活性；Zhu等开发的SNIPR受体成功消除背景活性并提升表达水平。时间延迟特性解释了Srivastava等发现的SynNotch-CAR逻辑门区分共定位细胞群的局限性——持续激活的TF导致靶基因（如CAR）在无抗原情况下仍表达。

结论

双荧光素酶检测法为SynNotch等合成受体的表征提供可靠方案。本研究证实抗CD19 SynNotch受体存在显著背景活性和24小时响应延迟，通过受体构造优化（如添加调控序列或采用新设计平台）可有效提升动态范围。

致谢

本研究获伊朗国家医学研究发展研究所（NIMAD）精英研究者基金（982494, 984179）支持。作者声明无利益冲突。