CD9相互作用组在细菌感染上皮细胞过程中的动态变化：邻近标记蛋白质组学揭示粘附平台调控机制

《The FEBS Journal》：Dynamics of the CD9 interactome during bacterial infection of epithelial cells by proximity labelling proteomics

本综述通过TurboID邻近标记技术首次系统描绘了CD9相互作用组在细菌感染过程中的动态变化。研究发现CD9作为通用组织者，通过调控不同的宿主蛋白复合物（如CD147、CD44等）介导脑膜炎奈瑟菌和金黄色葡萄球菌的粘附。该研究不仅揭示了CD9相互作用组在感染早期的特异性重组（如DGKD、NIPAL4等蛋白的招募），还证实CD9衍生肽（800C）能有效破坏细菌粘附平台，为抗感染治疗提供了新靶点。

　　

Abstract

细菌利用细胞膜上的不同受体粘附宿主细胞。本研究通过构建CD9-TurboID融合蛋白，首次采用邻近标记技术系统解析了CD9在上皮细胞中的相互作用网络。在未感染细胞中鉴定出710个富集蛋白，包括细胞外基质受体相互作用和紧密连接相关蛋白。已知细菌受体CD44、CD46和CD147也被检测到。在脑膜炎奈瑟菌和金黄色葡萄球菌感染过程中，CD9相互作用组呈现动态变化：脑膜炎球菌感染时12种人源蛋白富集，而葡萄球菌感染仅1种富集。基因敲低实验表明CD147和CD44分别特异性介导两种细菌的CD9依赖性粘附，且CD9衍生肽800C能有效破坏粘附平台。

Introduction

四跨膜蛋白（Tetraspanin）是一类具有四个跨膜结构域的蛋白超家族，通过形成四跨膜蛋白富集微域（TEM）参与细胞粘附、迁移和信号传导。CD9作为重要成员，可整合整合素、蛋白聚糖等膜蛋白形成分子复合物，成为多种病原体的感染门户。既往研究表明CD9不直接作为细菌受体，而是通过组织宿主膜蛋白（如syndecan-1、整合素等）介导细菌粘附。本研究聚焦脑膜炎奈瑟菌和金黄色葡萄球菌这两种分别利用CD147/CD46和CD44/整合素等不同受体的病原体，旨在揭示CD9相互作用组在感染过程中的动态重组机制。

Results

CD9缺失与肽段干预对细菌粘附的影响

CD9^?/? A549细胞中脑膜炎球菌和葡萄球菌粘附分别下降58.7%和49.2%。CD9衍生肽800C处理野生型细胞可显著抑制两种细菌的粘附（分别下降56.5%和41.0%），而 scrambled 肽无此效应。流式细胞术和Western blot显示CD9缺失引起CD44、CEACAM1/6表达下调，但CD46/CD147膜表达无显著变化，表明CD9对细菌粘附的调控不依赖于受体表达量改变。

CD9-TurboID融合蛋白的功能验证

将TurboID连接于CD9胞内C末端，构建的融合蛋白在CD9^?/?细胞中能正常定位于质膜，并恢复细胞对纤维连接蛋白的粘附能力及细菌感染表型。生物素标记实验显示该模型可在10分钟内高效标记邻近蛋白，且随时间推移标记蛋白数量增加。

CD9相互作用组的特征

在30/60/240分钟时间点分别鉴定出406/572/608个富集蛋白，其中332个为核心相互作用蛋白。已知CD9互作蛋白（如CD151、整合素α5β1、IgSF3）及细菌受体（CD147、CD44等）均被富集。亚细胞定位显示多数蛋白分布于质膜（240分钟时414个）和细胞质（488个），KEGG分析提示富集通路包括细胞粘附分子、ECM-受体相互作用、Rap1信号等。共定位和免疫共沉淀证实CD9与CD44/CD46/CD147存在相互作用。

感染诱导的相互作用组动态变化

脑膜炎球菌感染30分钟时富集8个蛋白（如SLC16A2、DGKD、NIPAL4），240分钟时富集4个蛋白（如PRKCI、DGKD）；而葡萄球菌感染仅30分钟时富集NIPAL4。这些蛋白涉及离子转运（NIPAL4）、细胞骨架重组（TRIOBP）和炎症信号调控（DGKD、UCHL1），提示细菌特异性招募宿主因子至CD9微域。

关键受体在CD9介导粘附中的作用

siRNA敲低实验表明：CD147缺失使脑膜炎球菌粘附下降56.4%，CD44缺失使葡萄球菌粘附下降50.4%，但二者无交叉抑制作用。800C肽处理与受体敲低无叠加效应，且CD9^?/?细胞中受体敲低不影响粘附，证实CD9与特定受体协同作用。细菌内化实验显示CD9干预不影响病原体内吞，表明其主要调控粘附早期阶段。

Discussion

本研究首次通过邻近标记技术绘制了CD9在上皮细胞中的动态相互作用图谱，揭示CD9作为"粘附平台组织者"的核心作用。不同细菌通过招募特异性蛋白（如脑膜炎球菌富集DGKD、葡萄球菌利用预形成的CD44-整合素复合物）定制CD9微域，而CD9衍生肽可破坏此类平台。该策略为针对多重耐药菌的抗粘附治疗提供了新思路。

Materials and Methods

使用CD9-TurboID慢病毒转染A549细胞，通过链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白，LC-MS/MS分析互作组。感染实验采用MOI=50的脑膜炎球菌MC58株和金黄色葡萄球菌SH1000株，通过CFU计数和显微镜评估粘附/内化。siRNA敲低、流式细胞术、免疫共沉淀等技术验证关键互作。