无标记外部切趾相位衬度显微技术实现活体哺乳动物细胞内膜结构的动态观测

《The FEBS Journal》：Label-free imaging of intracellular structures in living mammalian cells via external apodization phase-contrast microscopy

本刊推荐：本研究开发的外部切趾相位衬度（ExAPC）显微技术通过外部相位板设计有效抑制光晕伪影，实现了对活细胞中多种细胞器（如线粒体、脂滴、生物分子凝聚体）的高时空分辨率无标记成像。该技术结合荧光成像揭示了细胞器异质性（如IRS-1液滴折射率差异）和动态过程（如线粒体分裂/融合位点偏好性），为研究细胞器互作及相关疾病机制提供了重要工具。

　　

引言

细胞内的膜性结构细胞器通过其特有的尺寸、数量和空间排列构成细胞的组织形态特征。传统荧光成像技术虽能特异性标记细胞器，但存在光漂白和光毒性问题。近年来，无标记成像技术通过检测光与细胞相互作用产生的光学衬度，为细胞原位观测提供了新途径。切趾相位衬度显微镜通过环形孔径照明样本，利用带有光衰减环的切趾相位环诱导相位偏移，可显著减少光晕伪影。然而商用高倍率切趾相位衬度物镜的缺乏限制了其应用。本研究采用外部切趾相位衬度（ExAPC）显微术，将切趾相位板置于物镜外部，实现了对活细胞内膜结构的高质量成像。

ExAPC显微技术与光学衍射层析成像的比较

ExAPC作为二维相位成像技术，与可进行三维相位成像的光学衍射层析（ODT）技术相比，在显示细胞内结构形态方面结果一致。但ExAPC具有亚秒级时间分辨率优势，而ODT在Z轴扫描时难以达到同等时空分辨率。不过ODT在较厚样本成像中更具优势，表明两种技术应根据实验目的互补使用。

ExAPC对细胞器组织的可视化能力

通过ExAPC与荧光成像联用，成功识别出细胞核、核仁、线粒体等折射率区别于细胞质的结构，以及肌动蛋白丝。内质网（ER）在核周区域难以检测，但在细胞外周部分结构与ER标记物存在共定位。大量囊泡结构与内吞体、溶酶体标记物共定位，平均尺寸为0.177±0.168 μm²，与文献报道相符，故定义为"内吞体-溶酶体样结构（ELL）"。而高尔基体因折射率对比度低难以单独通过ExAPC识别。该技术在人癌细胞系（HeLa、HCT116等）和小鼠成纤维细胞中均适用，显示其广泛适用性。

ExAPC技术有效减少了光晕伪影，成功捕捉到HeLa细胞和人诱导多能干细胞（hiPSC）分裂过程中细胞器组织的精细变化。虽然在细胞凋亡或 entosis（细胞侵入）过程中因细胞变圆增厚仍会出现光晕，但未受影响区域的结构仍清晰可见，且支持长期稳定成像。

生物分子凝聚体及其类似结构的ExAPC分析

在HeLa细胞胞质中发现高度动态的球形结构（16.3%细胞中存在），其面积与平均强度弱相关，提示成分折射率存在差异。这些结构可发生融合事件，1,6-己二醇（1,6-HD）处理可使其溶解，高渗应激可诱导类似结构形成，故定义为"生物分子凝聚体样结构（BCL）"。BCL的周长和定位动态性显著高于核仁。

胰岛素受体底物1（IRS-1）液滴作为胰岛素/胰岛素样生长因子（IGF）信号传导的关键相分离结构，在U-2 OS细胞中通过GFP-IRS1外源表达被ExAPC观测到。23.5%的IRS-1液滴在荧光下可见但ExAPC中不可见，其荧光强度显著低于ExAPC可见液滴，提示IRS-1数量影响折射率。ExAPC与荧光成像测得的液滴面积强相关（中位数分别为0.47 μm²和0.39 μm²），但强度弱相关，表明液滴内分子数量和质量差异影响折射率。IRS-1液滴与细胞核、线粒体、ELL等细胞器存在相互作用，其中与ELL的接触频率高且持续时间短（<1秒），这种多位置、异时限的互作可能优化IRS-1介导的信号转导。

脂滴形成的ExAPC解析

通过油酸处理HeLa细胞诱导脂滴（LD）形成，结合疏水性荧光增强染料Lipi-Blue标记，ExAPC可追踪LD从出现到生长的全过程。直径小于450.4±70.9 nm的LD呈白/黑点状结构（Phase 1），超过此尺寸则变为环状结构（Phase 2/3），其外观随焦距变化。分析显示LD从Phase 1（直径285.6±66.2 nm，类似pre-LD尺寸）到Phase 3的过渡时间存在细胞间差异，生长速率为0.012±0.004×10^-3 μm³·s^-1，且未观察到融合或分裂事件。LD与线粒体、细胞核等细胞器存在相互作用，迁移速度为0.01±0.006 μm·s^-1，并呈现细胞特异性运动模式。

线粒体动态的ExAPC观测

为避免荧光成像的光毒性和光漂白问题，采用"荧光引导ExAPC成像"策略：初始同时采集ExAPC和荧光图像定位线粒体，后续仅用ExAPC进行高速成像。该方法成功捕捉到自发线粒体分裂和融合事件：分裂位点沿线粒体呈双峰分布，支持存在两种分裂机制；融合事件中80.7%发生在长度相似（较小者>30%）的线粒体之间。线粒体解偶联剂FCCP处理引起线粒体膜电位（ΔΨm）下降后，Hep3B细胞线粒体快速球状化，而U-2 OS细胞仅部分区域球状化，且个体线粒体反应存在异质性。ExAPC还观察到正常和FCCP处理条件下线粒体间的通讯行为，提示该过程不依赖ΔΨm。

讨论与展望

ExAPC显微术为多种细胞类型提供了无标记观测细胞器动态的强大工具，其高时空分辨率和多重成像能力克服了荧光标记的局限性。当前技术仍存在光晕伪影（尤其厚样本和成熟脂滴）、成像深度有限以及部分细胞器需荧光辅助识别等不足。未来结合计算成像（如深度学习校正）可进一步提升分析精度。对BCL、LD生物发生、线粒体形态异质性的定量研究，凸显了在生物分子凝聚体疾病机制研究中考虑异质性的重要性。ExAPC与ODT、荧光成像的技术互补性将为生命科学研究提供新的洞察力。