杜氏利什曼原虫酪氨酸磷酸酶与DUF21互作调控镁离子稳态的机制研究

《The FEBS Journal》：Leishmania donovani's protein tyrosine phosphatases interact with DUF21 and respond to environmental magnesium

本研究发现杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani）的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）与未知功能域21（DUF21）能形成特异性蛋白复合物，该互作体系类似于哺乳动物的PRL-CNNM镁感应通路。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建的PTP1/PTP2双敲除突变体（LdΔPTP1/2）在低镁环境中完全丧失存活能力，而DUF21敲除突变体（LdΔDUF21）则对高镁敏感并出现细胞内镁积累。研究首次揭示该互作系统在寄生虫应对环境镁离子波动中发挥关键作用，为针对镁稳态通路的新型抗利什曼病药物开发提供了理论依据。

　　

Abstract

杜氏利什曼原虫是引起内脏利什曼病（黑热病）的病原体，每年导致超过9万例感染。镁离子作为细胞内第二丰富的阳离子，对细胞正常功能至关重要，但寄生虫对镁的调控机制尚不明确。本研究聚焦利什曼原虫中与哺乳动物PRL（再生肝磷酸酶）和CNNM（细胞周期蛋白M家族）同源的两个蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP1/PTP2）及DUF21（未知功能域21）蛋白，探索其在镁离子稳态中的作用。

PTP1与DUF21的CBS结构域特异性互作

序列比对显示，利什曼原虫PTP1和PTP2与人类PRL蛋白的P-loop、催化半胱氨酸及WDP环等关键功能域高度保守。DUF21蛋白的CBS结构域中与PRL结合的长环区域同样存在保守性。通过GST pull-down实验，研究人员在HEK293细胞中证实PTP1能与DUF21的CBS结构域直接结合，而PTP2因表达量低未检测到明确互作。进一步点突变实验发现，将DUF21第385位天冬氨酸（D385）或PTP1第75位天冬氨酸（D75）突变为丙氨酸后，蛋白互作完全消失，表明该结合具有特异性。

CRISPR-SaCas9技术构建PTP及DUF21突变体

利用CRISPR-SaCas9基因编辑系统，团队成功构建了LdΔPTP1、LdΔPTP2、LdΔPTP1/2双敲除突变体及LdΔDUF21突变体。全基因组测序验证了抗生素抗性基因（bleoR/puroR）精准插入目标基因位点。所有突变体在含镁培养基中均能正常增殖，且基因拷贝数分析未发现补偿性扩增现象。

镁离子依赖性生存表型分析

在无镁培养基中，LdΔPTP1/2双敲除突变体完全丧失增殖能力，而LdΔPTP1或LdΔPTP2单敲除株系仍可存活。通过回补PTP1或PTP2蛋白可恢复双敲除突变体的低镁耐受性，其中PTP1的回补效果更显著。与之相反，LdΔDUF21突变体对高镁环境敏感，在额外添加150 mM MgCl₂的培养基中即无法存活，而野生型寄生虫可耐受250 mM MgCl₂。回补DUF21-GFP蛋白后，突变体的高镁耐受性恢复至野生型水平。

细胞内镁离子水平与巨噬细胞感染能力

采用Magnesium Green?荧光探针检测发现，LdΔDUF21突变体的细胞内镁离子水平显著升高，回补DUF21后恢复正常。LdΔPTP1/2的镁离子浓度与野生型无差异。在巨噬细胞感染实验中，LdΔPTP1/2的胞内存活数量在72小时显著降低，而LdΔDUF21突变体反而表现出更强的生存优势。该结果与巨噬细胞吞噬溶酶体的低镁环境特性相符，提示DUF21缺失导致的镁积累可能增强寄生虫在宿主体内的适应力。

讨论与展望

本研究首次在原生动物寄生虫中证实PTP-DUF21复合物对镁离子稳态的调控功能，其机制与哺乳动物PRL-CNNM通路高度相似。DUF21可能作为镁离子外排载体，而PTP通过与其结合抑制镁外排，从而维持细胞内镁平衡。针对该互作界面的抑制剂（如JMS-053）或可成为抗利什曼病的新策略。未来研究需进一步解析PTP2与DUF21的互作关系，并探索该通路在寄生虫生命周期其他阶段的作用。

材料与方法

实验涉及HEK293细胞转染、GST pull-down、CRISPR-SaCas9基因编辑、纳米孔测序、镁离子荧光检测及THP1巨噬细胞感染模型等技术。所有突变体均通过单克隆筛选及全基因组测序验证，统计学分析采用GraphPad Prism软件完成。