TGFβ通过整合素αv/CD51和半乳糖凝集素-3上调增强血小板-乳腺癌细胞相互作用并促进血小板聚集的机制研究

《The FEBS Journal》：TGFβ enhances platelet–breast-cancer-cell interaction and promotes platelet aggregation

本研究揭示了TGFβ在乳腺癌微环境中的关键作用：它通过诱导上皮-间质转化（EMT），显著上调MCF7细胞表面粘附分子整合素-αv/CD51和半乳糖凝集素-3（Galectin-3）的表达，从而增强血小板（PLT）与癌细胞的相互作用，并促进肿瘤诱导的血小板聚集（TCIPA）。该机制为癌症相关血栓（CAT）和转移进程提供了新的分子解释，提示靶向TGFβ信号通路或特定粘附蛋白或可为抑制肿瘤进展和血栓形成提供新策略。

　　

TGFβ刺激MCF7细胞发生上皮-间质转化（EMT）

研究首先探讨了转化生长因子β（TGFβ）对MCF7乳腺癌细胞系生物学行为的影响。研究人员在两种不同的细胞铺板密度（20,000 cells/cm²为低密度，60,000 cells/cm²为高密度）下，用10 ng·mL^-1的TGFβ处理MCF7细胞48小时。结果发现，TGFβ处理并不影响MCF7细胞的增殖能力。然而，在划痕实验中，低密度培养的MCF7细胞经TGFβ处理后，其迁移能力在划痕后48小时显著增强，而高密度培养的细胞则未观察到此种效应。

进一步分析EMT标志物发现，TGFβ处理显著降低了MCF7细胞表面E-钙粘蛋白（E-cadherin）的表达，并诱导细胞形态向更延展的间质细胞转变，细胞圆形度下降。在基因表达水平上，低密度培养的TGFβ处理组中，SNAI1、VIM和TWIST1等EMT相关基因的表达显著上调。值得注意的是，高细胞密度在一定程度上削弱了TGFβ诱导的部分EMT表型，例如划痕闭合能力和SNAI1基因的上调被抑制，这提示细胞间连接和培养密度可能调节TGFβ的信号传导。

TGFβ促进悬浮状态下血小板与MCF7细胞的相互作用

为了模拟循环系统中循环肿瘤细胞（CTC）与血小板的相互作用，研究团队将经过TGFβ预处理的MCF7细胞与用CFSE荧光染料标记的血小板在悬浮状态下共培养45分钟，并通过流式细胞术分析相互作用。结果显示，在低密度条件下，TGFβ预处理的MCF7细胞与血小板结合的能力（CFSE⁺细胞百分比）显著高于未处理组（NT）。然而，在高密度条件下，TGFβ处理组与未处理组之间则无显著差异。

为了探究血小板自身释放的TGFβ是否具有类似效应，研究人员用血小板释放物（Releasate）预处理MCF7细胞。结果表明，血小板释放物同样能增强MCF7与血小板的结合，而这种效应可被TGFβ受体抑制剂（TGFβi）所逆转，证实了血小板源性TGFβ在此过程中的重要作用。

TGFβ处理的MCF7细胞促进血小板活化与聚集

接下来，研究评估了经TGFβ预处理的MCF7细胞对血小板功能的影响。将MCF7细胞与血小板共孵育后，通过检测血小板表面活化标志物P-选择素（CD62P）的表达来评估血小板活化程度。研究发现，与未处理的MCF7细胞共孵育即可引起血小板活化（CD62⁺血小板百分比升高），而经TGFβ预处理的MCF7细胞则能进一步显著增强这种活化效应。

通过光谱法测定血小板聚集动力学发现，在凝血酶激活的血小板中，与TGFβ预处理的MCF7细胞共孵育后，血小板的聚集程度（最大聚集百分比）显著高于与未处理MCF7细胞共孵育组。而未激活的血小板，其聚集程度很低。这表明TGFβ通过改变癌细胞特性，增强了其诱导血小板聚集（TCIPA）的能力。

TGFβ刺激上调MCF7细胞表面的整合素-α_v/CD51和半乳糖凝集素-3（Galectin-3）

为阐明TGFβ增强血小板-癌细胞相互作用的分子机制，研究人员检测了MCF7细胞表面一系列已知参与细胞-血小板相互作用的粘附分子的基因和蛋白表达。基因表达谱分析显示，在低密度培养条件下，TGFβ处理显著上调了整合素-α_v（ITGAV / CD51）和半乳糖凝集素-3（LGALS3）的mRNA水平。流式细胞术分析进一步证实，在低密度条件下，TGFβ处理显著增加了MCF7细胞表面CD51和Galectin-3蛋白的表达水平（平均荧光强度MFI和阳性细胞百分比）。然而，在高密度培养条件下，TGFβ的这种上调效应则不明显。

抑制整合素-α_v/CD51逆转TGFβ促进的血小板-MCF7相互作用，而抑制半乳糖凝集素-3则无效

为了验证CD51和Galectin-3在介导相互作用中的功能，研究使用了特异性抑制剂：Cilengitide（整合素-α_v抑制剂）、GB1107（Galectin-3抑制剂）和GLPG0187（整合素-α_v/α5β1抑制剂）。细胞毒性实验表明，在1 μM的工作浓度下，这些抑制剂对细胞活力无显著影响。

在血小板-MCF7相互作用实验中，只有Cilengitide能够有效逆转TGFβ预处理所增强的相互作用，使其恢复至未处理组的水平。而GB1107和GLPG0187则未能显著抑制TGFβ增强的相互作用。这表明整合素-α_v/CD51在介导TGFβ增强的血小板-癌细胞粘附中扮演了关键角色。

整合素-α_v/CD51和半乳糖凝集素-3的抑制剂均能抵消TGFβ预处理对MCF7诱导血小板聚集的增强效应

研究人员进一步检验了这些抑制剂对血小板自身聚集能力以及MCF7诱导的血小板聚集的影响。结果显示，Cilengitide和GB1107本身并不影响凝血酶诱导的血小板聚集。而GLPG0187则几乎完全抑制了血小板的聚集能力，这可能与其非特异性作用有关。

在MCF7诱导的血小板聚集实验中，所有三种抑制剂（Cilengitide, GB1107, GLPG0187）均能显著降低TGFβ预处理组所增强的血小板聚集，使其最大聚集程度降至与未处理MCF7诱导的水平相当。有趣的是，尽管GB1107未能抑制血小板与癌细胞的粘附，但它却能抑制癌细胞诱导的血小板聚集，这表明粘附过程与聚集诱导过程可能涉及部分独立的机制。

乳腺癌蛋白质组学数据集分析揭示TGFβ1与血小板标志物ITGA2B（CD41）呈显著正相关

通过对已发表的乳腺癌蛋白质组学数据集（Johansson et al. 和 Krug et al.）进行分析，研究人员考察了TGFβ1与血小板特异性标志物ITGA2B（CD41）在不同乳腺癌亚型中的相关性。Spearman相关性分析显示，在管腔A型（Luminal A）乳腺癌中，TGFβ1与ITGA2B的表达呈显著正相关。在三阴性乳腺癌（TNBC）的一个数据集中也观察到了显著正相关。此外，在伴有淋巴结转移（N≥1）或处于II期、III期的乳腺癌样本中，这种正相关性更为明显。这提示在特定亚型和更晚期的乳腺癌中，血小板浸润与TGFβ信号通路可能存在更强的关联。

为了在体外模拟肿瘤局部血小板-癌细胞的相互作用，研究还进行了粘附条件下的共培养实验。免疫荧光显微镜观察显示，与未处理的MCF7细胞相比，TGFβ预处理的MCF7细胞表面结合了更多的CFSE标记的血小板，进一步支持了TGFβ在肿瘤微环境中也能促进血小板-癌细胞相互作用的观点。

讨论与总结

本研究系统阐明了TGFβ在调控血小板与乳腺癌细胞相互作用中的核心作用。TGFβ通过诱导MCF7细胞发生EMT，上调其表面粘附分子整合素-α_v/CD51和半乳糖凝集素-3的表达，从而增强了癌细胞与血小板的结合能力，并最终促进了血小板的活化和聚集。这种增强的相互作用不仅可能有助于循环中癌细胞的免疫逃逸和转移定植，同时也为癌症相关血栓（CAT）的发生提供了一个潜在的机制解释。

研究还发现，细胞培养密度显著影响TGFβ的效应，低密度条件下（模拟脱离细胞连接的侵袭性细胞）TGFβ的信号传导更为有效，这提示在体内，具有更强侵袭性的癌细胞亚群可能对TGFβ的促相互作用信号更敏感。

靶向抑制整合素-α_v（如Cilengitide）或半乳糖凝集素-3（如GB1107）能够特异性干扰TGFβ增强的癌细胞诱导血小板聚集，而不影响血小板的基本功能，这为开发针对癌症转移和CAT的靶向治疗策略提供了新的思路，可能有助于避免传统抗血小板药物带来的出血风险。

最后，对临床乳腺癌样本的生物信息学分析为TGFβ-血小板轴在特定乳腺癌亚型（如管腔A型）和疾病进展中的相关性提供了支持性证据，强调了该机制潜在的临床意义和异质性。未来的研究需要进一步在体内模型中验证这些发现，并探索在其他癌症类型中是否存在类似的机制。