埃塞俄比亚阿姆哈拉Awi地区意大利蜜蜂原始蜂蜜的体外抗菌活性研究

《MicrobiologyOpen》：In Vitro Antibacterial Activity of Raw Honey From Apis mellifera, Awi Zone, Amhara, Ethiopia

本文评估了埃塞俄比亚Awi地区意大利蜜蜂（Apis mellifera）所产原始蜂蜜的理化特性及体外抗菌活性。研究发现，蜂蜜样本的水分含量（13 ± 0.07%–20 ± 0.09%）和pH值（3.76–4.01）均符合标准，且100%纯蜂蜜对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等五种病原菌表现出显著抑制效果，其抑菌圈直径（inhibition zone）随浓度稀释（100%至25%）而减小，表明原始蜂蜜可作为有效的细菌性疾病（bacterial disease）治疗剂。

　　

Graphical Abstract

蜂蜜样本采集自Awi地区的多个区域。蜂蜜样本的水分含量和pH值分别为13 ± 0.07%–20 ± 0.09%和3.76–4.01。100%纯蜂蜜样本对测试的细菌病原体表现出最大的抑菌圈，而25%浓度的蜂蜜样本则显示出最低的抑菌圈。

ABSTRACT

蜂蜜自古以来就被用于治疗各种疾病，常用于烧伤、微生物感染、心血管疾病和胃肠道问题的治疗。本研究旨在评估由意大利蜜蜂（Apis mellifera）所产蜂蜜的理化特性及其对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的体外抗菌特性。蜂蜜样本于2023年4月至6月期间从Awi地区的三个区域收集。按照标准程序测定了所收集蜂蜜的pH值和水分含量。使用琼脂井扩散法（agar well diffusion assay）进行了蜂蜜样本的抗菌敏感性测试。来自三个研究地点的蜂蜜样本的水分含量和pH值分别为13 ± 0.07%–20 ± 0.09%和3.76–4.01。三个地点采集的蜂蜜样本在pH值方面没有显著差异（p > 0.05）。同样，蜂蜜样本的水分含量之间也没有显著的统计学关联（p > 0.05）。100%纯蜂蜜样本对大肠杆菌（E. coli）表现出最大的抑菌圈（19.20 mm），对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的抑菌圈最小（2.4 mm）。25%浓度的蜂蜜对所有测试的细菌病原体均显示出最低的抑菌圈。蜂蜜溶液的抗菌效果随着从100%到25%的连续稀释而降低。我们的研究结果表明，原始蜂蜜可用作对抗细菌性疾病的治疗剂。

1 Introduction

天然产物（Natural product）的利用作为食品保存和医疗治疗的方法正日益普及。蜂蜜是蜜蜂生产的天然商品，其干重的95%–97%由碳水化合物组成。所有蜂蜜的主要成分相同，但其组成会根据蜜蜂采食的花卉种类而变化。人类使用蜂蜜治疗各种疾病的历史至少有2700年。古希腊人用蜂蜜治疗痛风、疼痛、发烧和伤口愈合，而埃及人则将其用作局部软膏、伤口敷料以及尸体防腐。蜂蜜中含有来自植物和蜜蜂的生物活性物质（bioactive compounds），这些化合物在消除和预防有害微生物传播方面起着至关重要的作用。蜂蜜的微生物杀灭能力与其高渗透压效应（high osmotic effect）、高酸度（high acidity）、高过氧化氢含量（high hydrogen peroxide content）和植物来源有关。蜂蜜的抗菌活性自19世纪就已为人所知。

有报道称麦卢卡蜂蜜（Manuka honey）对包括大肠杆菌、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和金黄色葡萄球菌在内的人类病原菌具有有效的抑制活性。此外，研究表明来自不同来源的各种蜂蜜对从患者分离的耐药菌株具有抗菌特性，这些菌株包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、鼠伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和李斯特菌（Listeria monocytogenes）。由于细菌对抗菌药物产生耐药性，细菌性疾病的治疗变得具有挑战性。此外，医学界最近重新发现了蜂蜜作为治疗成分的用途，它作为褥疮、胃肠道溃疡和其他表面感染的抗菌治疗正被越来越广泛地接受。大约80%的埃塞俄比亚人口通过传统方法获得初级医疗治疗。蜂蜜常被用作胃肠道疾病、伤口愈合、腹泻和过敏的传统疗法。因此，研究蜂蜜的理化和抗菌特性至关重要。

2 Materials and Methods

2.1 Study Site

研究在埃塞俄比亚阿姆哈拉民族区域的Awi地区进行。该地区海拔在700至2920米之间，土地面积约为857,886公顷。Awi地区总面积约为9148.43平方公里。该地区首府为Injibara，距离亚的斯亚贝巴约447公里，距离巴赫达尔约118公里。根据埃塞俄比亚2007年中央统计局数据，Awi地区总人口为982,942人，其中男性491,865人，女性491,077人。

采样区域的位置如图1所示。

Figure 1 研究区域地图。

2.2 Honey Sample Collection Procedure

总共从Awi地区的三个区域（Guagusa shikudad, Guangua, 和 Jawi）采集了21份蜂蜜样本，采集时间为蜂蜜收获季节（2023年4月至6月），使用无菌螺旋盖无菌瓶采集。样本在市场日从当地养蜂人处收集。无菌采集的蜂蜜样本被送至Injibara大学生物系实验室，并在生物安全柜下使用无菌纱布过滤。采用划线法（streak plate method）将蜂蜜样本接种于无菌营养琼脂（nutrient agar）上，随后在37°C下培养24小时以检查纯度。无污染的蜂蜜样本储存于阴凉避光处。

2.3 Physicochemical Characteristics of Honey

2.3.1 pH Measurement

使用校准的pH计测量蜂蜜样本的pH值。

2.3.2 Moisture Content

使用官方分析化学师协会（Association of Official Analytical Chemists）开发的公式测定蜂蜜样本的水分含量。水分含量（%）= {M₂ ? M₃ / M₂ ? M₁} ? 100，其中 M₁ 为坩埚重量（g），M₂ 为坩埚和样品重量（g），M₃ 为坩埚和干燥样品重量（g）。

2.4 Source of Test Organisms

标准细菌培养物试管斜面，包括大肠杆菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）和肺炎克雷伯菌（ATCC 13883），取自埃塞俄比亚巴赫达尔的阿姆哈拉公共卫生研究所（Amhara Public Health Institute）。将试管斜面培养物划线接种于营养琼脂上，在35 ± 1°C下培养24小时，以检查细胞活力。将存活的细菌培养物通过划线接种于无菌营养琼脂斜面上保存，以供后续工作使用。

2.5 Preparation of Honey Concentrations

制备了25%、50%、75%和100%纯蜂蜜的不同稀释度。75%蜂蜜浓度（v/v）通过将0.75 mL蜂蜜与0.25 mL无菌蒸馏水稀释制备。同样，0.5 mL蜂蜜与0.5 mL无菌蒸馏水混合得到50%浓度，0.25 mL蜂蜜与0.75 mL无菌蒸馏水混合得到25%蜂蜜溶液（v/v）。

2.6 Antimicrobial Susceptibility Test of Honey

使用琼脂井扩散技术评估蜂蜜样本的抗菌特性。将纯细菌分离物从营养琼脂斜面取出并传代培养于营养琼脂上，然后在37°C下培养24小时。将约3-5个分离的细菌菌落接种到无菌营养肉汤（nutrient broth）中并充分混合。在37°C下培养6小时后，将培养物与0.5麦氏浊度标准（0.5 MacFarland standards）进行比较。使用无菌棉签将肉汤培养物均匀涂布在无菌穆勒欣顿琼脂（Mueller Hinton agar）培养基上。将平板置于实验台上以吸收多余的液体。使用无菌6 mm打孔器在培养基上制备孔。使用微量移液器将100%、75%、50%和25%的蜂蜜浓度加入平板孔中。将平板在37°C下培养24小时。使用直尺（mm）记录抑菌圈直径，并记录结果。使用无菌蒸馏水作为阴性对照（negative control），而氯霉素（chloramphenicol）抗菌片则用作阳性对照（positive control）。每个标准细菌物种的实验平板重复三次。

2.7 Statistical Analysis

使用SPSS 16.0版进行数据分析。实验结果表明为三次测量的平均值±标准差（mean ± standard deviations, SD）。采用方差分析（Analysis of variance, ANOVA）确定变量间的显著性差异（p < 0.05）。

3 Results and Discussions

3.1 Physicochemical Properties of Honey (pH and Moisture Content)

本研究结果显示，从三个区域（Guagusa Shikudad, Guangua, 和 Jawi）采集的蜂蜜样本的平均水分含量（%）和pH值分别为13% ± 0.07%–20% ± 0.09%和3.76 ± 0.16–4.01 ± 0.24。单因素方差分析显示，来自三个区域的蜂蜜样本的pH值之间没有显著的统计学关联（p > 0.05）。同样，来自选定区域的蜂蜜样本的水分含量之间也没有显著的统计学关联（p > 0.05）。蜂蜜的水分含量主要影响其质量、稳定性和对酵母发酵腐败的抵抗力。

蜂蜜的水分含量自然变化范围可从13%到23%，具体取决于蜂蜜来源、气候条件和其他因素。所调查蜂蜜样本的平均水分含量范围为13% ± 0.07%至20% ± 0.09%，平均值为16.66% ± 0.12%。与我们的发现基本一致，有报道称实验室分析的蜂蜜水分组成范围在16.34% ± 0.26%至19.83% ± 0.43%之间。Gregorio等人也报告了类似的结果，显示测试蜂蜜样本的水分含量在17.78%至18.51%之间。Berhe等人也报告了接近的蜂蜜样本水分含量，平均值为18.76% ± 1.09%。此外，Gebeyehu和Jalata发现蜂蜜样本的平均水分含量为19.82% ± 0.22%。与我们的结果相反，Brown等人报道了更高的蜂蜜水分含量，范围为16.9%–32.4%。另外，Nweze等人发现蜂蜜的平均水分含量较低，为11.74% ± 0.47%。根据2001年食品法典委员会（Codex Alimentarius 2001）标准，原蜜的最大水分含量不应高于23%，我们的结果符合此标准。蜂蜜的pH值影响其质地、稳定性和保质期，对于提取和储存都至关重要。

我们研究中的蜂蜜样本的理化分析确认其呈酸性pH，范围在3.76 ± 0.16至4.01 ± 0.24之间，平均值为3.85 ± 0.25。认为有机酸，包括葡萄糖酸（gluconic acid）、丙酮酸（pyruvic acid）、苹果酸（malic acid）和柠檬酸（citric acids），是蜂蜜低pH值的原因。不同蜂蜜样本之间pH值的差异是由于环境的植物区系组成和花卉多样性造成的。但我们的研究结果显示，来自三个区域的蜂蜜样本的pH值之间没有统计学显著性（p > 0.05）。与我们的结果可比，Fahim等人报道测试蜂蜜样本的pH值保持在3.14至4.19之间。同样，从埃塞俄比亚西绍阿（west Shewa）地区采集的蜂蜜样本的pH值测定为3.77–4.22。此外，来自埃塞俄比亚阿姆哈拉东部的报告显示平均pH测量值为3.59 ± 0.25。Yemane等人在埃塞俄比亚南部的Gamo地区也报告了类似的结果，显示蜂蜜的平均pH值为3.80，这与我们的结果一致。蜂蜜的低pH值具有防止微生物生长的优势，并表明蜂蜜样本的新鲜度。

3.2 Antibacterial Activity of Honey

实验室结果表明，细菌生长模式的抑菌圈从未稀释的蜂蜜到最小稀释度逐渐减小（见表1）。单因素方差分析显示，四种不同浓度的蜂蜜产生的平均抑菌圈与阳性和阴性对照相比存在统计学显著差异（p < 0.05）。在100%浓度下，所有蜂蜜样本均表现出抗菌特性。细菌的抑菌圈随着蜂蜜浓度的增加而增加。然而，25%的蜂蜜浓度对所有测试的细菌均显示出最低的细菌生长抑制圈。此外，阴性对照（0%）无菌水对测试细菌没有任何抑制作用。最小抑菌圈测量为0 mm，是针对25%蜂蜜浓度下的铜绿假单胞菌。最大抑菌圈记录在100%蜂蜜浓度下针对大肠杆菌（22.02 mm）。阳性对照氯霉素（30 μg）对所有细菌（除铜绿假单胞菌外）显示出不同程度的生长抑制。

Table 1. 不同浓度蜂蜜对病原菌的抗菌活性。

浓度 (%)	大肠杆菌	金黄色葡萄球菌	肺炎克雷伯菌	铜绿假单胞菌	伤寒沙门氏菌
0 (NC)	0 ± 0a	0 ± 0a	0 ± 0a	0 ± 0a	0 ± 0a
25	15.73 ± 4.39b	9.21 ± 5.65b	1.23 ± 2.71b	0 ± 0b	10.08 ± 3.38b
50	21.18 ± 13.23c	12.42 ± 1.71b	5.43 ± 4.44c	0.57 ± 1.52b	12.63 ± 2.56b
75	21.68 ± 13.44c	13.26 ± 2.15c	8.71 ± 2.76d	0.62 ± 1.54b	12.76 ± 3.95c
100	22.02 ± 13.44c	16.45 ± 5.07d	11.55 ± 2.59d	1.93 ± 3.22b	18.16 ± 4.06d
PC	28.54 ± 23.56d	26.07 ± 45.03e	16.79 ± 67.24e	0 ± 0c	22.28 ± 32.90e

注：氯霉素（30 μg）。数值表示为三次重复的平均值±标准差。列中具有不同上标字母的平均值表示在（p < 0.05）水平上存在统计学显著差异。

缩写：NC = 阴性对照（无菌水），PC = 阳性对照。

有报道称，大多数人类病原菌，包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes），对蜂蜜敏感。记录到的最大抑菌圈约为28.54 mm，针对大肠杆菌，但对铜绿假单胞菌未检测到抑制作用（0 mm）。100%蜂蜜浓度显示出一个清晰的生长抑制序列，大肠杆菌表现出最大的平均抑菌圈（22.02 mm），其次是伤寒沙门氏菌（18.16 mm）和金黄色葡萄球菌（16.45 mm）。相比之下，肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌表现出较小的抑菌圈，分别为11.05 mm和1.93 mm。此外，25%的蜂蜜浓度对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌分别显示出15.73 mm、9.2 mm和10.08 mm的清晰抑菌圈。铜绿假单胞菌不受25%蜂蜜浓度的影响，而肺炎克雷伯菌的生长抑制测量值为1.23 mm。与我们的实验结果一致，Rahman等人指出，100%蜂蜜浓度对所有较低浓度均表现出更大的抑菌圈，而6.25%的稀释度在测试金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和志贺氏菌（Shigella）物种时没有显示出任何影响。Al-Naama发现，蜂蜜在100%、75%和50%浓度下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌表现出体外抑制效果，但在25%浓度下没有，最大抑菌圈测量值在100%蜂蜜浓度下为23 mm。与我们的发现可比，Mudenda等人显示，100%浓度的蜂蜜分别以22 mm和20 mm抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，而25%的生长抑制分别为15 mm和13 mm。Mustafa等人的报告也显示，在100%蜂蜜浓度下，大肠杆菌的平均抑菌圈最高为37.5 mm，而对粪肠球菌（Enterococcus faecalis）观察到的最低抑制为23 mm。然而，Ndife等人报道了蜂蜜对细菌的较低抑制圈，针对来自不同花卉区域的蜂蜜，金黄色葡萄球菌为1.70–5.85 mm，大肠杆菌为2.10–6.10 mm，枯草芽孢杆菌为2.05–3.20 mm。

蜂蜜对细菌的抑制活性归因于渗透效应、低pH值和过氧化氢的产生。在我们的实验研究中，铜绿假单胞菌是对蜂蜜浓度和阳性对照（氯霉素）最具抵抗力的革兰氏阴性菌。与我们的结果可比，蜂蜜对临床铜绿假单胞菌的抑制活性也很小。铜绿假单胞菌对蜂蜜的抵抗力可能源于控制耐药基因的染色体基因突变、细胞壁的通透性有限以及表达耐药机制的遗传潜力。

4 Conclusions

研究结果显示，所调查蜂蜜样本的水分含量和pH值均在国家和国际标准的可接受范围内。在五种测试的细菌病原体中，大肠杆菌对蜂蜜浓度表现出最高的敏感性；然而，铜绿假单胞菌表现出最高水平的耐药性。蜂蜜对细菌病原体的总体抑菌圈随着从100%到25%的稀释而减小。在25%的蜂蜜浓度下，未记录到对测试细菌的任何显著生长抑制。我们的结果将有助于利用蜂蜜作为治疗由细菌病原体引起的疾病的治疗剂。

Author Contributions

Bulti Kumera: 概念化（conceptualization），方法论（methodology），撰写初稿（writing – original draft），审阅和编辑（writing – reviewing and editing）。Bekele Gebreamanule: 方法论（methodology），数据管理（data curation），软件（software）。Belsti Atnkut: 形式分析（formal analysis），调查（investigation），撰写初稿（writing original draft）。Mestawot Merid: 项目管理（project administration），验证（validation），可视化（visualization）。Tadele Tilahun: 调查（investigation），形式分析（formal analysis），资源（resource）。Alemu Tsega: 软件（software），监督（supervision），验证（validation）。Amare Fassil: 监督（supervision），项目管理（project administration），审阅和编辑（writing – review and editing）。Yitayih Dessie: 数据管理（data curation），方法论（methodology），撰写初稿（writing – original draft）。Banchalem Kassie: 监督（supervision），资源（resource），审阅和编辑（writing – review and editing）。所有作者阅读并批准了最终稿件。

Acknowledgments

作者无内容报告。

Ethics Statement

作者无内容报告。

Conflicts of Interest

作者声明无利益冲突。