探索马来西亚半岛原住民社区鲍曼不动杆菌的基因组特征与抗菌耐药性潜力

《MicrobiologyOpen》：The Road Less Traveled: Exploring the Genomic Characteristics and Antimicrobial Resistance Potential of Acinetobacter baumannii From the Indigenous Orang Asli Community in Peninsular Malaysia

本文对马来西亚半岛原住民社区健康个体携带的鲍曼不动杆菌进行了基因组分析，揭示了其显著的遗传多样性（包括新的ST型）和携带的耐药基因（如blaOXA-51-like、blaADC）。这些分离株虽为共生菌，但其基因组特征与临床菌株相似，凸显了其在特定条件下致病的潜力。研究强调了对其（AMR）基因和毒力因子进行基因组监测的重要性，并为理解社区病原体的进化提供了新视角。

　　

1 引言

碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌被世界卫生组织列为最高优先级的关键病原体。然而，公共基因组数据库中的鲍曼不动杆菌基因组数据主要偏向于医院来源的分离株，对健康社区个体，尤其是与城市人群隔离的土著社区中的鲍曼不动杆菌知之甚少。马来西亚半岛的Orang Asli原住民社区许多位于偏远农村，与现代医疗（包括抗生素和疫苗）接触有限，形成了独特的“基因组胶囊”——即该社区特有的微生物基因组。因此，研究这些社区中携带的鲍曼不动杆菌，有助于了解其与医院菌株的差异及潜在致病性。

2 材料与方法

2.1 样本采集与鲍曼不动杆菌分离

研究在马来西亚半岛东海岸登嘉楼州的两个Orang Asli村庄（Kampung Sungai Pergam和Kampung Berua）进行。采集参与者的鼻拭子和鼻咽拭子，使用多种培养基进行常规细菌学分离，并通过MALDI Biotyper初步鉴定为不动杆菌属。

2.2 抗生素敏感性试验

使用美罗培南和环丙沙星药敏片进行纸片扩散法，使用四环素和多西环素MIC E-test条测定最低抑菌浓度，依据EUCAST标准判断敏感性。

2.3 基因组测序与组装

提取9株鲍曼不动杆菌分离株的基因组DNA，使用Illumina MiSeq平台进行全基因组测序。原始读数经fastp质控和修剪后，使用Unicycler进行基因组组装，并使用Quast评估组装质量。

2.4 生物信息学分析

使用fastANI计算平均核苷酸一致性；使用Prokka进行基因组注释；使用mlst和PubMLST数据库进行多位点序列分型（MLST），包括牛津和巴斯德两种方案；使用Kaptive进行荚膜K位点和脂寡糖OC位点分型；使用AMRFinderPlus和ABRicate分析耐药基因；使用ABRicate和VFAnalyzer分析毒力因子；使用PlasmidFinder和AcinetobacterPlasmidTyping数据库鉴定质粒及其复制子类型；使用pdifFinder和手动搜索鉴定pdif位点；使用TADB 3.0数据库分析毒素-抗毒素系统；使用ISEScan和ISfinder数据库筛查插入序列；通过本地BLAST鉴定comM耐药岛热点。

2.5 泛基因组与系统发育分析

使用Anvi'o平台比较9株Orang Asli分离株与其他社区鲍曼不动杆菌基因组的泛基因组。使用Roary和VeryFastTree构建核心基因组系统发育树，并使用iTOL可视化。

3 结果与讨论

3.1 Orang Asli来源鲍曼不动杆菌的初步基因组分析

从130名参与者中分离出13株推测的不动杆菌属分离株，经全基因组测序确认其中9株为鲍曼不动杆菌。基因组大小约3.7-3.9 Mbp，与泰国、越南和马来西亚的鲍曼不动杆菌基因组具有>97%的核苷酸一致性。MLST分析显示高度的遗传多样性：牛津方案鉴定出6个新的序列型，巴斯德方案鉴定出3个新的序列型。表面多糖位点分型发现4个新的荚膜类型和多种OCL类型，其中一株为与澳大利亚社区获得性肺炎相关的OCL13型。新ST型和荚膜型的出现提示了该社区内可能存在遗传独特谱系。

3.2 基因型AMR观察揭示非主流的β-内酰胺酶

所有分离株均携带内在的bla_OXA-51-like碳青霉烯酶基因和bla_ADC头孢菌素酶基因，但未检测到获得性碳青霉烯酶基因。所有分离株对美罗培南表型敏感，且其bla_OXA-51-like基因上游均无ISAba1等插入序列，表明这些基因可能低表达或不表达。bla_ADC基因也呈现多样性，且上游无ISAba1。与马来西亚医院菌株普遍携带bla_ADC-73不同，社区菌株的ADC变异谱系多样，且与另一项马来西亚社区研究中的菌株也存在差异，表明不同社区菌株的AMR谱系可能不同。

3.3 Orang Asli社区鲍曼不动杆菌分离株中的其他耐药基因

两株分离株携带tet(39)四环素耐药基因，并表现为四环素耐药、多西环素敏感，这与医院菌株主要携带tet(B)的情况不同。五株分离株携带ant(3″)-IIa氨基糖苷类耐药基因。一株分离株携带sul2磺胺类耐药基因。这些耐药基因的携带情况与医院菌株有差异，提示社区菌株的耐药基因谱具有独特性。

3.4 Orang Asli社区鲍曼不动杆菌的毒力组

毒力因子分析显示，这些分离株携带大量与粘附、生物膜形成和群体感应调控相关的基因。所有分离株均具有完整的lps-lpx基因簇，与免疫逃避相关。五株分离株携带完整的VI型分泌系统基因簇，并被鉴定为T6SS-1A或T6SS-1B型，部分菌株还携带Tse4等效应蛋白。这表明这些社区菌株可能具有在多物种环境中生存、入侵和定植宿主的潜力。

3.5 Orang Asli鲍曼不动杆菌分离株具有遗传多样性

泛基因组分析显示，Orang Asli分离株与马来西亚另一社区研究的分离株相比，核心基因比例较低，cloud基因比例高，表明社区菌株间遗传异质性强。核心基因组系统发育树显示，医院菌株主要聚集在GC2谱系，而社区菌株（包括Orang Asli和Segamat社区菌株）则分散在系统树中，与一些非GC临床菌株交织在一起，提示它们可能在有机会时引起感染。一株Orang Asli分离株属于GC8谱系。医院菌株的comM基因普遍被耐药岛插入中断，而社区菌株的comM基因大多完整。

3.6 插入序列

共鉴定出17个属于5个家族的插入序列，其中ISAba43在所有9个基因组中均有发现。其他IS元素较少见，其中IS1006已知与质粒介导的AMR区域相关，但在此研究中未发现其与耐药基因关联。

3.7 Orang Asli社区鲍曼不动杆菌的质粒携带情况

除一株菌外，其余八株均携带质粒，其中三株携带两个质粒。鉴定出的质粒多为小型质粒，主要属于Rep_3家族。大多数质粒为隐性质粒，不携带AMR基因。两株四环素耐药的菌株在其Rep_3型质粒上携带tet(39)–tetR基因对，该基因对位于可移动的pdif模块中。这些质粒的遗传结构与临床菌株中发现的类似质粒具有相似性，表明它们可能作为耐药基因传播的载体。尽管社区抗生素暴露有限，但质粒介导的四环素耐药性可能通过环境和生态相互作用得以维持和传播。

3.8 展望、局限性与未来研究建议

本研究通过对偏远原住民社区鲍曼不动杆菌的基因组分析，响应了WHO关于加强AMR监测的呼吁。主要局限性包括使用短读长测序平台导致基因组组装不完整，以及样本量较小。未来应进行更广泛的纵向研究，增加表型药敏试验的抗生素种类，并通过功能实验验证新ST型和荚膜型在生物膜形成、环境压力抵抗和宿主免疫逃避中的作用。

4 结论

与临床菌株相比，来自偏远Orang Asli社区的鲍曼不动杆菌分离株表现出较低的抗生素耐药性，但仍携带一系列毒力因子和可移动遗传元件。其中一株属于GC8临床谱系，且社区菌株在系统发育上与部分非GC医院菌株交织，表明其具有在机会条件下致病和获得耐药性的潜力。在两种不同的质粒中检测到位于可移动pdif模块中的tet(39)–tetR基因对，警示了耐药基因在脆弱社区中传播的风险。因此，扩大基因组监测至社区来源的菌株，对于理解鲍曼不动杆菌的流行病学动态和制定公共卫生策略至关重要。