产前外显子组测序结合拷贝数变异分析在结构异常胎儿中的应用：一项具有临床实践意义的多中心前瞻性队列研究

《Prenatal Diagnosis》：Prenatal Exome Sequencing Analysis in Fetuses With Structural Anomalies: A Multicenter Prospective Cohort Study With Practical Implications

本刊推荐：这项多中心前瞻性队列研究证实，在染色体微阵列分析（CMA）和核型分析阴性的结构异常胎儿中，整合拷贝数变异（CNV）和单核苷酸变异（SNV）分析的产前外显子组测序（ES-CNV/SNV）可将诊断率提升至29.45%，尤其在复发性异常组中诊断率高达40.68%。研究首次在1.45%的病例中鉴定出CNV/SNV复合杂合变异，并扩展了5个基因和36个变异的产前表型-基因型关联，为提升产前诊断精准度和遗传咨询提供了关键证据。

　　

引言

先天性畸形影响2%–3%的活产儿，约占围产期死亡病例的25%。这些胎儿结构异常范围广泛，从轻度孤立缺陷到致命性多系统异常。识别这些异常的遗传病因对于评估预后、预测再发风险和指导临床决策至关重要。常规产前细胞遗传学分析和染色体微阵列分析（CMA）是此产前诊断环境中的主要工具。虽然CMA在结构异常胎儿中比常规核型分析提高3%–6%的诊断率，但仍有相当一部分病例无法解决，凸显出现有方法无法完全弥合的诊断鸿沟。来自产前外显子组测序（ES）分析的新证据表明，其在先前检测未解决的病例中具有识别遗传病因的潜力；然而，临床实施需要进一步的实证验证。

美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG；2020年）建议，产前ES在常规染色体分析和CMA阴性结果后，可作为一种有价值的补充工具。这种方法重新定义了产前诊断范式。尽管有其潜力，产前ES分析仍面临关键挑战。首先，不完整的胎儿表型分析——特别是由于次优的超声分辨率掩盖了细微的结构异常——以及对仅在妊娠期表现的疾病机制理解有限，影响了诊断准确性。其次，复发性先天性异常通常提示遗传病因，但由于基于证据的临床数据不足而难以解释。另一层复杂性来自复合杂合变异——包括拷贝数变异（CNV）和单核苷酸变异（SNV）的组合——这作为常染色体隐性遗传病中双等位基因功能障碍的原因不容忽视。CMA的技术局限性（缺乏检测小外显子水平CNV的分辨率）以及当前缺乏将CNV分析整合到ES工作流程中的具体建议，加剧了这一差距。总的来说，这些未解决的挑战强调了通过临床表型分析和分析框架的实际改进来系统解决这些差距的迫切需求。

本研究通过前瞻性评估大型队列中的ES来解决这些差距，重点关重复发性异常和CNV分析的整合。重要的是，本研究还探索了目前未记录或罕见报道的产前表型，以及在产前和产后期间表现差异的基因，有助于更深入地理解产前背景下的基因型-表型关联。

材料与方法

2.1 受试者纳入标准

孕妇符合以下纳入标准则具备资格：（i）胎儿有异常超声发现。第一组包括散发性单系统异常，限于心脏、骨骼、泌尿生殖系统、中枢神经系统（CNS）或水肿异常，先证者是家庭中第一个出现此特定表型的个体。第二组包括散发性多系统异常，具有不止一种不限于上述五个单系统的结构异常。第三组包括复发性异常，定义为在一次以上的妊娠中、在夫妇或其近亲中出现相同类型的结构异常。每个机构需每月提交产前超声图像进行质量审查。（ii）染色体分析和CMA检测结果正常。（iii）夫妇同意参与并提供全面的检测信息和家族史。排除标准包括：（i）有侵入性产前诊断程序禁忌症的孕妇（例如，先兆流产、发热、出血倾向、慢性感染活动期）；（ii）未能满足家系研究、验证或随访研究要求的病例；以及（iii）分析样本量不足。

2.2 外显子组测序分析和变异注释

收集亲本外周血和胎儿样本用于DNA提取。提取的DNA使用Agilent SureSelect Human All Exon V6捕获试剂盒进行捕获，并在NovaSeq 6000平台上以150 bp双末端模式进行测序。平均覆盖深度为100×，Q20 ≥ 85%且Q30 ≥ 80%。使用GRCh37（hg19）参考基因组，我们采用结合BWA比对和GATK变异检测的标准流程分析测序数据，以识别全外显子组的SNV和INDEL。随后使用NxClinical v5.0进行并行检测SNV和CNV（本研究定义为ES-CNV/SNV）。使用ANNOVAR和InterVar对变异进行注释，包括计算机预测信息、人群等位基因频率以及疾病-表型关联。根据ACMG指南进行变异的致病性解读。SNV/indel通过Sanger测序验证，而CNV通过qPCR按照标准方案进行确认。

2.3 候选变异筛选和验证

我们将胎儿表型信息手动转换为标准的人类表型本体（HPO）术语，用于过滤和优先排序变异。根据等位基因频率、预测的蛋白质影响、遗传模式和表型-基因型关联选择候选变异，重点关注新生、纯合、复合杂合和半合子变异。能够完全或部分解释胎儿异常的病理性/可能病理性（P/LP）变异被视为阳性诊断。意义不明确的变异（VUS）仅在以下情况下被视为具有临床相关性：（1）分离分析与遗传模式一致；（2）计算机工具预测具有破坏性效应；（3）表型与已知基因关联匹配。

2.4 染色体微阵列分析（CMA）

基因组DNA进行酶切、连接接头、PCR扩增、纯化和生物素标记。标记的DNA与Affymetrix CytoScan 750K阵列杂交。然后按照制造商说明洗涤和扫描芯片。原始强度数据导入Chromosome Analysis Suite（ChAS）v3.1软件进行初步处理，随后进行信噪比和log2强度比等指标的质量控制评估，以确保数据可靠性。使用软件默认算法识别CNV和单核苷酸多态性（SNP），并应用严格过滤标准以最小化假阳性。

2.5 统计分析

使用Prism软件进行两组间的统计比较，采用Fisher精确检验。P值 < 0.05被认为具有统计学显著性。

结果

3.1 队列特征

2018年11月至2021年1月期间，从中国15个产科中心招募孕妇。这15个产科中心隶属于中国八个不同地区。共筛选了360名有胎儿超声检查异常的孕妇的资格，其中85人因不符合标准或样本不足被排除。最终，275个核心家系（包括两对双胞胎）纳入我们的队列：128例胎儿显示散发性单系统异常（心脏38例，骨骼39例，泌尿生殖系统16例，中枢神经系统26例，水肿9例），88例有多系统异常，59例有复发性异常。胎儿DNA主要从羊水（n=136）和流产组织（n=98）中提取，其次是脐带血（n=30）、绒毛膜绒毛（n=10）和心脏血（n=1）。检测时，母亲中位年龄29.8岁（范围20-42），父亲中位年龄33.5岁（范围20-50），中位孕次2.4（范围1-6），中位孕龄21⁺²周（范围11⁺⁴-38周）。194例胎儿可获得妊娠结局，包括78例终止妊娠（TOP），98例流产，1例新生儿死亡和17例活产；其余81例胎儿结局未知。

3.2 诊断率和亚组分析

ES-CNV/SNV分析确定275个核心家系中有81个获得诊断，诊断率为29.45%。此外，15例携带具有潜在临床意义的变异，包括9例复合杂合（2例P/VUS，2例LP/VUS，5例VUS/VUS），1例半合子VUS和5例来自有相应表现亲本的显性遗传VUS。根据ACMG SF v2.0指南，1.82%的病例报告了次要发现。另外，9.45%的队列中鉴定出与儿童期发病疾病相关的P/LP偶然发现。

在216例散发性异常胎儿中，ES-CNV/SNV分析在57例（26.39%）中识别出诊断性变异。单系统（32/128, 25.00%）和多系统（25/88, 28.41%）异常组之间的诊断率无显著差异。相比之下，复发性异常组（n=59）表现出显著更高的诊断率40.68%（24/59, p < 0.05）。

在128例散发性单器官异常胎儿中，诊断率因解剖系统而异。骨骼畸形（41.03%, 16/39）和水肿（33.33%, 3/9）的比率最高，其次是泌尿生殖系统异常（25.00%, 4/16）、中枢神经系统异常（19.23%, 5/26）和心脏异常（10.53%, 4/38）。在复发性异常组（n=59）中，致病变变最常见于泌尿生殖系统畸形（75.00%, 3/4）和中枢神经系统畸形（58.33%, 7/12），其次是多系统异常（44.44%, 4/9）和面部异常（42.86%, 3/7）。

3.3 常见分子诊断涉及的基因

在81例确诊胎儿中，识别出54个基因。在所有单基因疾病中，三个基因在超过三例病例中涉及，包括COL1A1（n=7）、FGFR3（n=6）和L1CAM（n=4），合计占所有确诊胎儿的20.99%（17/81）。另有12个基因各在2-3例胎儿中涉及。在综合征胎儿中，由KMT2D引起的Kabuki综合征（KS）最常在三个胎儿中诊断。其他四种综合征各在两例胎儿中检测到。

3.4 骨骼发育不良的分子诊断

骨骼异常在单系统异常中诊断率最高（41.03%）。在我们队列78例有骨骼异常的胎儿中，49例为孤立病例（19例确诊），29例有额外的非骨骼异常（13例确诊）。这两个亚组之间的诊断率无显著差异。孤立病例进一步细分为孤立肢体畸形、伴有胸廓狭窄等额外骨骼特征的肢体缺陷以及其他无肢体受累的骨骼异常。在这19例确诊的孤立骨骼病例中，识别出九个致病基因，主要与成骨不全症和软骨发育不全相关。

3.5 复发性异常组的分子诊断

在59例有复发性结构异常的胎儿中，24个家庭（24/59, 40.7%）确定了明确的分子诊断：11例妊娠终止，7例自然流产，6例失访。L1CAM变异（在七个确诊的中枢神经系统病例中的四个中发现）是脑积水的主要驱动因素；在该中枢神经系统亚组中还鉴定出DCC、SMARCA4和CPLANE1的P/LP变异。在四个泌尿生殖系统病例（三个确诊）中，鉴定出ACTG2、PKD1和TMEM67的变异。特别是胎儿148携带TMEM67变异，表现为羊水过少、巨膀胱和多囊肾——与3型Meckel综合征特征一致。三个有唇腭裂的家庭分别显示了FLNB、COL2A1和IRF6的P/LP变异。除分子诊断病例外，其余家庭中15.25%（9/59）携带临床相关的VUS。

3.6 确诊病例的遗传模式分析

确诊病例的遗传模式显著影响妊娠管理，特别是在评估受影响妊娠的预后和后续妊娠再发风险方面。在81例确诊病例中，42例（51.85%）携带新生变异（再发风险等同于普通人群）。相比之下，15例（18.52%）为常染色体隐性遗传，在后续妊娠中赋予25%的再发风险。五例（6.17%）显示X连锁隐性遗传（半合子变异，男性后代50%再发风险）。其余19例（23.46%）显示显性遗传模式，关联50%再发概率。复发组的遗传模式（91.67%遗传 vs. 8.33%新生）与散发性单系统异常组（34.38%遗传 vs. 65.62%新生）和多系统异常组（24.00%遗传 vs. 76.00%新生）显著不同（p < 0.05）。

在复发组中，两例病例（胎儿249和胎儿118）在亲本血液DNA中未检测到变异。这一发现强烈提示生殖系嵌合体，因为局限于生殖系的低水平嵌合体可以解释复发。值得注意的是，胎儿118在NEB基因中携带复合杂合变异，同时在KMT2D中携带LP变异。此外，胎儿224的复发性巨膀胱源于ACTG2致病变变结合母体体细胞嵌合体（血液中7.51%），提示母体生殖系嵌合体可能导致两次连续妊娠中相同异常的复发。

3.7 ES-CNV/SNV分析

先前我们证明，通过结合ES与CNV-seq/CMA并行分析CNV和SNV，在核型阴性病例中提高了诊断效用。然而，以前使用这种方法的研究尚未报道同一基因内涉及CNV和SNV的复合杂合变异病例。通过整合的ES-CNV/SNV分析，我们鉴定了四例具有CNV/SNV复合杂合组合的病例，占整个队列的1.45%（4/275）和所有确诊病例的3.70%（3/81）。代表性例子包括P3H1相关的股骨/胫骨畸形、EVC2相关的心脏/肢体缺陷、COG5致病的先天性糖基化障碍和GLDN介导的致死性先天性挛缩综合征。此外，另外四个与常染色体显性遗传相关的致病性外显子水平CNV未被CMA检测到。与CMA在检测外显子水平CNV方面的局限性相比，ES-CNV/SNV分析提高了诊断效能，并为临床管理提供了全面的遗传信息。

3.8 产前-产后表型差异和新表型-基因型关联

产前表型可能与产后表现显著不同。例如，与Kabuki综合征（产后以智力残疾和面部畸形为特征）相关的KMT2D产前变异，在三例病例中与严重的多系统异常（例如，胎儿水肿）相关，但缺乏面部畸形——突出了产前对系统病理学而非诊断性面部特征的侧重。类似地，虽然RYR1变异通常导致新生儿肌张力低下和骨骼肌疾病，但携带RYR1变异的胎儿204和胎儿205未显示胎儿运动不能，而是表现出非特异性发现如胎儿水肿。这些观察表明，特异性和偶然的产前影像学发现可能为识别遗传病因提供关键线索。

据我们所知，这是首次在产前鉴定出五个基因——B3GALT6、CDH2、CHD4、DLL1和FOXJ1——的P/LP变异的研究。与CHD4、DLL1和FOXJ1相关的疾病主要在产后表现为功能异常。CHD4与Sifrim–Hitz–Weiss综合征（一种智力发育障碍）相关。携带CHD4从头错义变异c.3454A>G的胎儿226在孕早期颈项透明层增厚，孕24周时出现先天性心脏缺陷、心包积液、胎儿水肿、腹水和肢体畸形。携带DLL1变异的胎儿067表现为侧脑室后角扩张达14.5毫米（右）和15毫米（左）。在胎儿255中检测到FOXJ1变异（与纤毛运动障碍相关），表现为脑积水。此外，在携带B3GALT6和CDH2变异的病例中注意到结构异常。与脊椎发育不良Ehlers–Danlos综合征相关的B3GALT6变异导致胎儿087出现骨骼异常。类似地，携带CDH2从头变异的胎儿132表现为胼胝体发育不全、右心室双出口和流出道形态异常。此外，我们鉴定了36个先前未在ClinVar、HGMD、dbSNP、Mastermind或PubMed中记录的新SNV，从而扩展了疾病相关基因的表型谱。

讨论

这项调查展示了一个大型前瞻性多中心（n=15）产前三人家系ES队列（275例病例）的结果。通过将CNV分析整合到ES工作流程中，我们在常规染色体分析和CMA阴性的病例中实现了29.45%的增量诊断率。该比率与Mellis等人的系统评价和荟萃分析中报告的31%诊断率密切对应，并超过了Fu等人先前大型队列研究中观察到的14.2%的诊断率。值得注意的是，我们对复发性异常的诊断率40.68%（24/59）与Pauta等人报告的结果一致。相比之下，单系统先天性心脏异常表现出较低的诊断率，这种差异可能归因于遗传和表型异质性。

本研究强调了ES-CNV/SNV分析在复发性胎儿异常中的诊断效用，诊断率达到40.68%（24/59）。这一结果支持ES分析作为有复发性胎儿异常家庭的关键诊断工具。具体而言，我们的研究结果显示，复发性异常中91.67%（22/24）的P/LP变异是从父母遗传的，强调了在孕前或孕早期进行ES分析结合家系分离分析以识别隐性或低外显率变异的必要性。这种方法使得从反应性诊断转向主动预防，通过胚胎选择进行植入前遗传学检测（PGT）进一步降低复发风险。这些策略共同巩固了ES分析作为管理复发性胎儿异常的基石，与先前的研究一致。

几项研究已经证明了在产前环境中同时分析CNV和SNV的临床效用，无论是通过CNV-seq结合ES分析还是整合的ES-CNV/SNV分析。然而，关于CNV和SNV/indel复合杂合对遗传病因的贡献数据仍然有限，特别是在产前环境中，尤其是对于低于CMA检测阈值的外显子水平CNV。在这里我们鉴定了四例这样的病例，占总队列的1.45%（4/275）。该比率超过了先前回顾性分析中报告的比率，突出了这些遗传相互作用被低估的重要性。在这些病例中，胎儿236和胎儿175体现了复发性异常表型。此外，四个与常染色体显性遗传病相关的致病性外显子水平CNV未被CMA检测到。这强调了ES-CNV/SNV策略在临床实践中的临床效用。特别是在常染色体隐性遗传病中仅检测到一个SNV/indel致病变变且与临床表型相关的情况下，关注另一个常规CMA和ES分析能力之外的反式致病外显子水平CNV非常重要。鉴于妊娠晚期诊断的时间敏感性，本文提出的扩展ES-CNV/SNV工作流程可以作为标准CMA的更有效替代方案，从而实现及时的遗传咨询和临床决策。

使用ES进行准确的分子诊断需要将遗传数据与全面的表型评估相结合。然而，产前表型通常在范围上有限、非特异性或与产后临床发现不一致，从而使诊断准确性复杂化。首先，尽管产前影像学有所改进，但功能表型仍无法通过这些方法检测到，强调了产前表型特征对于早期遗传诊断的价值。例如，与产后智力残疾相关的CHD4，在胎儿226中被产前识别出伴有系统性异常，但无中枢神经系统缺陷。其次，同一基因的变异可能产生不同的产前表型。例如，在我们的队列中，在六个胎儿中鉴定出FGFR3基因的从头变异，其中五个表现为孤立性骨骼发育不良，除了胎儿021带有c.1948A>G变异，表现出颅脑畸形。这种变异性源于变异对基因功能的不同影响或表型的延迟出现，突出了包括早期扫描在内的系列成像对于随时间监测胎儿发育的重要性。第三，产前和产后表型之间的差异阻碍了基因型-表型关联。例如，最常见的产前诊断基因主要与结构异常相关，而产后病例更常涉及神经或代谢障碍，缺乏明确的结构标志物。这种对比强调了需要更新变异数据库（ClinVar和HGMD）以包含胎儿特异性注释，以澄清产前基因型-表型关系。最后，验证性测试——例如通过羊水或母体血清质谱法进行N-聚糖定量——对于验证基因组发现至关重要。

这项前瞻性研究在一个大型队列（n=275个核心家系）中评估了ES-CNV/SNV分析在产前诊断中的效用，旨在提高对胎儿结构异常潜在遗传病因的检测效率。关键局限性包括高度选择性的纳入标准、复发性异常亚组中的小样本量以及不完整的结局数据（仅194/275胎儿），高终止率（64%）限制了对长期临床结局和产后表型关联的评估。尽管收集了详细的表型，产前表型分析本质上仍不如产后评估精确，这使变异解读和遗传咨询复杂化。纯粹的中国队列可能限制对其他人群的普适性。此外，15.01%的病例产生了VUS结果，强调了需要加强国际数据共享和功能研究以提高变异分类准确性。