新型SLICK复合肉牛品种的培育及其在温带环境热应激耐受性中的优势研究

《Canadian Journal of Animal Science》：Development of a new composite SLICK beef cattle breed for improved tolerance to heat stress in temperate environments

本文推荐了一项针对温带地区肉牛热应激问题的创新育种研究。作者通过将Senepol牛的SLICK基因型（显性遗传）与Galloway牛的耐寒特性结合，培育出新型复合品种（3/8 Senepol、1/8 Red Angus、1/2 Galloway）。研究证实，在温度湿度指数（THI）高于72时，SLICK基因型个体表现出显著更低的呼吸频率（p<0.05）和更高的活动水平（p<0.05），而热休克蛋白70（HSP70）表达无组间差异。该复合品种成功保留了SLICK基因的耐热优势，为应对气候变暖下的畜牧业挑战提供了新策略。

　　

摘要

牛（Bos taurus）热应激因气候变化已成为北美肉牛产业日益关注的问题，即使在温带地区也是如此。SLICK表型是Senepol牛的一种显性性状，可增强耐热性，但极端寒冷事件也构成挑战。为应对这两种气候极端情况，研究人员开发了一种复合品种（3/8 Senepol、1/8 Red Angus、1/2 Galloway），并通过呼吸频率、活动水平、瘤胃温度和热休克蛋白70（HSP70）表达评估其热应激耐受性。在变化的温度湿度指数（THI）条件下，对17头复合牛（11头SLICK、6头非SLICK）和6头安格斯对照牛进行了评估。当THI水平高于72时，SLICK复合牛的呼吸频率显著更低（p<0.05），并保持了更高的活动水平（p<0.05）。所有组别的瘤胃温度均与THI呈负相关。组间HSP70表达未观察到显著差异（p>0.05）。研究表明，SLICK复合牛具有优异的表型耐热性状。这些发现证实，尽管引入了Galloway遗传学，SLICK基因型赋予的耐热性仍然有效，支持了该复合品种在温带地区肉牛生产中的热应变可行性。

引言

牛（Bos taurus）热应激是北美肉牛产业的一个新兴问题。热应激是指导致产热和散热失衡的环境条件，可能对生长、繁殖力、肉质和整体健康产生诸多不利影响。为减轻热应激的影响，动物利用一系列行为和生理反应，统称为热应变，这些反应通常在温度湿度指数（THI）达到72及以上时观察到。这些反应包括呼吸频率增加、体力活动减少、体温升高以及热应变期间致力于细胞稳态的基因表达增加，例如热休克蛋白70（HSP70）。由于气候变化导致环境温度升高，热应激的不利影响变得越来越有害和普遍，即使在加拿大等传统上更偏北的气候区，热应激此前不被视为问题。先前的研究表明，热应激是温带气候下牛的一个新兴问题，尤其是在饲养场而非牧场环境中。常见的加拿大肉牛品种，如安格斯牛和盖洛威牛，适应较低的温度，然而，随着气候的变化，这些品种在日益高温的时期可能会遇到困难。

解决肉牛产业热应激问题的一个可能方案是引入以SLICK表型为特征的耐热性状。SLICK表型是Senepol牛品种固有的特征，表现为短而光滑的被毛，减少了辐射热吸收， coupled with 出汗能力增强，增加了热损失。SLICK毛发的动物通过降低直肠温度和阴道温度以及在环境温度升高期间降低呼吸频率，显示出对热应变的耐受性更强。SLICK表型源于Littlejohn等人描述的催乳素受体（PRLR）基因中的单核苷酸缺失（rs517047387; chr20:39099214GC>G）。该由rs517047387引起的移码变异引入了提前终止密码子，截断了受体的胞质尾。由于其常染色体显性遗传模式，SLICK基因型可以通过控制育种 readily 引入其他牛品种。

据估计，加拿大的年平均气温增长速度约为全球平均速度的两倍，因此，大多数省份的极端高温期变得更加 intense，这使未来的牛生产面临风险。大多数北部地区的北美肉牛经营可能会受益于SLICK表型耐热特性的引入；然而，观察到的北美整体气温上升将面临日益多变的气候挑战，导致极端天气事件，如极地涡旋。此外，SLICK毛发杂交动物的成功取决于消费者/农民对该品种相对于更熟悉的品种（如安格斯牛）的好处的认知。为了解决这些考虑因素，研究人员通过体外受精（IVF）技术，使用一头3/4 Senepol和1/4 Red Angus公牛的的精子和两头Galloway小母牛的卵母细胞，培育了一种3/8 Senepol、1/8 Red Angus和1/2 Galloway的复合品种。Galloway牛被认为是一种耐寒品种，生长着厚重且双层被毛，在寒冷气候下减少散热，提供耐寒特性。将Galloway纳入育种计划，可能是为了将其冬季耐寒品种固有的耐寒双层被毛引入到在较暖条件下会脱毛的复合品种中。理想情况下，这种复合品种将表现出对极端高温和寒冷的耐受性，同时保持牛肉消费者熟悉的典型Red Angus肉类特征。然而，先前的研究声称，由催乳素（PRL）基因中的常染色体显性变异（rs520582588）导致的过度多毛被毛与SLICK表型可能是相互排斥的。

在本研究中，研究人员通过表型评估呼吸频率、活动水平、瘤胃温度和HSP70表达，比较了黑安格斯牛和他们的复合牛（具有和不具有PRLR中特定的SLICK单核苷酸缺失）的耐热性状。与SLICK表型相关的PRLR缺失的存在可能会提高其复合品种的热应激耐受性。相反，Galloway的遗传影响可能会抑制或降低SLICK表型的耐热益处。

方法

研究动物

Senepol Red Angus复合牛 × Galloway杂交牛是通过将两头纯种Galloway母牛供体与一头携带SLICK基因型杂合子的3/4 Senepol 1/4 Red Angus复合公牛杂交，采用体外受精技术生产的。存活的胚胎被植入各种安格斯杂交代孕母牛体内。黑安格斯小母牛被用作实验对照，并与复合牛一起饲养。

研究地点

所有评估的动物均在加拿大不列颠哥伦比亚省比弗德尔市的巴克湖牧场饲养，该牧场位于基洛纳东南约60公里处。这块260公顷的拥有地契的物业海拔822米，适合低成本肉牛饲养，并利用周围广阔的租赁林地提供夏季放牧，为动物提供遮荫休息区。比弗德尔属于湿润大陆性气候，昼夜温差为加拿大最大之一，使其成为评估不同气候极端条件下牛的理想地点。

基因分型

对所有评估的动物进行了rs517047387缺失（SLICK）和rs520582588变异（PRL）的基因分型。使用南阿尔伯塔理工学院赠送的定制耳标和组织采集系统收集耳组织样本。使用改良的Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit方案从耳组织中提取DNA。56°C孵育步骤延长至12小时，并在MaxQ? 420 HP恒温台式轨道振荡器中以100 rpm振荡。使用0.1 μL Phusion高保真DNA聚合酶、2 μL 5X缓冲液、1 μL 0.4 mmol/L dNTPs、1 μL每种引物（5 pmol）、2 μL甜菜碱、2 μL模板DNA（1.5 ng/μL至20 ng/μL）和0.9 μL dH2O进行PCR扩增。rs517047387（SLICK）检测的正向引物和反向引物分别为5′-CCTGGATCTTGACAGTGACTCTG-3′和5′-TTTGGGAACAGAGCCAGCAC-3′。rs520582588（PRL）检测的正向引物和反向引物分别为5′-GTTTGCCAGGGAATGGATCATT-3′和5′-ACTCCCGTCCCTGCAAACTAAG-3′。SLICK检测使用62°C的退火温度，PRL检测使用60°C退火温度。所有反应均在SimpliAmp? Thermal Cycler中进行。

所有PCR扩增产物均使用ExoSAP-IT? Express进行纯化，以备Sanger测序。使用BigDye? Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit进行测序反应，并使用BigDye Xterminator? Purification Kit进行纯化。所有测序反应均使用SeqStudio? instrument进行测序，并通过输出的电泳图谱确定rs517047387的基因型。仅使用Phred分数高于30的电泳图谱对动物进行基因分型。

呼吸频率

使用Mufford等人开发的一种新技术收集呼吸频率数据，该技术涉及使用无人机来最小化观察者对测量的影响。所有动物背部还粘贴了独特的牛栏标签，以便于空中识别。数据收集期发生在四个不同的2小时时段：2023年7月15日13:00–15:00，以及2023年7月16日07:00–09:00、13:00–15:00和19:00–21:00，对应一次独特的THI超过72的热事件。使用DJI Mavic 3T四轴飞行器和DJI Mavic Enterprise Advanced四轴飞行器记录牛的视频，飞行高度为地面以上3-5米。当定位在牛群上方时，四轴飞行器为每头牛录制至少3分钟的稳定视频。使用Vortex? Viper? HD 3000激光测距仪确认牛的身份。在这些收集期间，使用Kestrel 5400AG Cattle Heat Stress Tracker便携式气象站记录环境温度和相对湿度（RH）。然后使用这些数据计算THI，使用以下方程：THI = (1.8 × T_a + 32) - (0.55 - 0.0055 × RH) × (1.8 × T_a - 26)，其中T_a是环境温度（°C），RH是相对湿度（%）。

从无人机捕获的视频使用Observer XT软件处理，以量化每头动物的呼吸频率。通过手动计数胁腹运动来计算呼吸频率。仅包括持续时间超过2分钟的胁腹运动计数。胁腹运动计数除以记录时间以计算每分钟呼吸次数。

呼吸频率数据使用Shapiro–Wilk检验进行正态性检验，用于下游分析。使用Kruskal–Wallis检验和配对Wilcoxon秩和检验确定每个时期样本组之间的差异。使用Benjamini–Hochberg程序调整来控制错误发现率（FDRs）。使用Kendall’s tau等级相关来确定每个牛组的呼吸频率与THI之间的相关性。所有数据分析和可视化均在R 4.2.3统计软件中进行。使用dplyr包进行数据操作，使用ggpubr、tidyverse和patchwork包进行数据可视化。

Moonsyst瘤胃螺栓

2023年5月15日，所有动物均使用33 mm投药枪将Moonsyst螺栓经食道插入。每个螺栓的唯一标识符被记录并分配给Moonsyst系统中的相应动物。Moonsyst系统定期使用加速度计记录每头动物的运动以及瘤胃温度。螺栓持续记录活动和瘤胃温度，并每小时合并数据，当在接收器范围内时，数据会立即发送到Moonsyst网关接收器。如果牛超出接收器范围，则螺栓保存数据直至进入范围。每小时的运动数据自动标记通过Moonsyst螺栓内三轴加速度计预设的三个不同级别（低、高、非常高）的活动阈值的运动次数。根据活动阈值值，使用以下方程计算活动指数（A_I）：A_I = A_L + 2A_H + 3A_VH，其中A_L是低活动，A_H是高活动，A_VH是非常高活动。

从彭蒂克顿机场气象站收集了螺栓数据收集相同时段的RH和温度，这些数据从名为Weather Underground的公开数据库下载。彭蒂克顿机场站（49°27′26″N, 119°36′25″W）海拔345米，是距离不列颠哥伦比亚省比弗德尔（49°28′51″N, 119°02′40″W）最近的气象站，两地相距37.38公里，海拔差477米。然后使用RH和温度测量值，使用上述方程计算THI。

使用Shapiro–Wilk检验确定A_I和瘤胃温度数据的正态性。然后对A_I数据进行Kendall’s tau等级相关检验，以确定A_I和瘤胃温度是否与THI相关。应用LOESS回归来可视化A_I的趋势。使用Kruskal–Wallis检验和配对Wilcoxon秩和检验评估样本组之间的差异。通过应用Benjamini–Hochberg调整程序控制所有统计检验中的FDR。此外，通过将数据划分为每个跨度四个THI增量的等宽区间，进一步评估A_I和瘤胃温度。除了LOESS回归和Kendall’s tau等级相关之外，对所有区间数据应用了为总体A_I概述的所有统计检验。此外，使用Kruskal–Wallis和Wilcoxon秩和检验比较每个牛组的区间数据之间的A_I和瘤胃温度。所有统计分析和可视化均使用R 4.2.3统计软件完成。使用dplyr包进行数据操作和组织，使用ggpubr、tidyverse和patchwork包生成最终可视化。

HSP70表达分析

在两个时间点收集毛发样本，2023年5月15日（基线）和2023年8月3日（实验期）。从牛的尾巴上拔下毛发，确保毛囊存在，并将毛囊朝下放入装有5 mL RNA_later的离心管中。样本在冰上保存，然后存入-20°C冰箱直至RNA提取。

使用PureLink? RNA Mini Kit和TRIzol试剂提取总RNA。将毛发样本的毛囊在冰上解冻，然后剪成适当大小，放入预先装有3 mm氧化锆珠的2 mL Geno/Grinder?管中。将管子放入Geno/Grinder?冷冻模块中，该模块置于-80°C冰箱中至少60分钟。所有样本放入各自的管子后，将冷冻模块放入SPEX? SamplePrep Geno/Grinder?仪器中。然后在1300 rpm下将样本均质化30秒，共三个循环，每个循环之间休息30秒。在RNA提取过程中使用柱上PureLink? DNase Treatment以消除DNA污染。使用39 μL无RNase水洗脱RNA，然后加入1 μL RiboLock进行稳定。使用NanoDrop One仪器定量RNA的纯度和浓度。RNA提取后立即使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit进行cDNA转换。然后使用NanoDrop One仪器定量cDNA。

使用实时PCR（qPCR）测量HSP70的相对基因表达。为HSPA1A（HSP70）和两个内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和β-微管蛋白异构体5（TUBB）定制了TaqMan检测法，使用Primer Express 3.0.1软件设计引物。所有qPCR反应均使用5 μL Fast Advanced Master Mix、0.5 μL 20X TaqMan检测法、3.5 μL dH₂O和1 μL模板cDNA制备。20X检测法定制为引物浓度900 nmol/L，探针浓度250 nmol/L。所有qPCR反应均设三个复孔，并在QuantStudio 7仪器中进行。

从QuantStudio 7仪器收集循环阈值（Ct）值，如果三个复孔中至少有两个成功，则用于下游分析，因为两个一致的复孔可能是可靠的。通过使用2^?ΔΔCt方法计算实验数据和基线数据之间的倍数变化来分析基因表达数据。使用以下方程：ΔCt = Ct_TE - Ct_CE，ΔΔCt = ΔCt_E - ΔCt_B，倍数变化 = 2^-ΔΔCt，其中Ct_TE是实验HSP70的平均Ct，Ct_CE是实验内参对照（GAPDH和TUBB）的平均平均Ct，Ct_TB是基线HSP70的平均Ct，Ct_CB是基线内参对照（GAPDH和TUBB）的平均平均Ct。倍数变化值用于统计分析。从名为Weather Underground的公开数据库下载彭蒂克顿机场气象站的RH和温度测量值，以计算两个收集期前7天的THI。

使用Shapiro–Wilk检验检验倍数变化值的正态性。使用Kruskal–Wallis检验和配对Wilcoxon秩和检验比较样本组。在所有统计检验中应用Benjamini–Hochberg程序以减轻FDR。所有统计分析和绘图均使用R 4.2.3统计软件完成。使用dplyr和qpcr包进行数据转换。使用ggpubr、tidyverse和patchwork包生成数据的最终图形表示。收集两个毛发收集期前7天的THI值，以比较每个收集期前每日平均峰值温度。

伦理声明

概述的所有程序均根据加拿大动物护理委员会指南进行，并得到汤普森里弗斯大学动物护理委员会的批准（档案号：102823）。

结果

所用动物和基因分型

育种共生产了17头Senepol Red Angus × Galloway复合犊牛。Sanger测序显示，11头复合牛为SLICK基因型杂合子，而6头没有SLICK基因型（非SLICK）。此外，所有六头黑安格斯对照小母牛均通过基因分型确认没有SLICK基因型。在SLICK复合牛中，五头为雌性，而非SLICK复合牛中三头为雌性。研究中使用的所有动物均没有PRL变异。

呼吸频率

通过使用无人机录像计数胁腹运动，在四个时间段收集了所有17头牛的呼吸频率数据。使用Shapiro–Wilks检验确定收集的数据为非参数分布（p = 5.05 × 10^?4）。每个收集期的平均THI记录为：7月15日13:00–15:00时为74.41 ± 1.21，7月16日07:00–09:00时为67.11 ± 3.38，13:00–15:00时为75.55 ± 1.49，19:00–21:00时为70.62 ± 1.61。所有牛组的呼吸频率均与THI呈正相关（安格斯：τ = 0.819, p = 2.70 × 10^?7；非SLICK：τ = 0.639, p = 6.02 × 10^?5；SLICK：τ = 0.712, p = 6.41 × 10^?10）。当THI水平高于72时，所有牛组之间的差异具有统计学意义（p < 0.05），安格斯牛的呼吸频率最高，SLICK牛最低。

活动指数

使用从Moonsyst螺栓收集的加速度计数据得出的活动指数（A_I）评估活动水平。总共收集并分析了15,059个数据点，THI范围为50.79–77.81。使用Shapiro–Wilks检验确定数据为非参数分布（p = 7.24 × 10^?14）。Kruskal–Wallis检验显示数据内存在统计学显著差异（p = 5.87 × 10^?26）。Wilcoxon秩和检验显示安格斯和非SLICK之间（p = 2.12 × 10^?18）以及SLICK和非SLICK之间（p = 6.85 × 10^?22）的A_I存在差异，非SLICK动物在两个比较中总体中位数活动指数较低。然而，未观察到安格斯和SLICK之间的差异（p = 0.0766）。然而，当THI增加时，安格斯和SLICK的LOESS回归趋势线似乎出现分歧。Kendall’s tau等级相关显示非SLICK（τ = 0.042, p = 2.79 × 10^?4）和SLICK（τ = 0.049, p = 5.59 × 10^?9）牛的A_I与THI存在极弱正相关，而安格斯牛无相关性（τ = ?0.01, p = 0.267）。在区间化的A_I中，分歧差异更为明显，在THI高于72 ± 2时，SLICK牛观察到更高的中位数A_I。所有THI区间经Kruskal–Wallis检验确认均存在统计学显著差异（p < 0.05）。在THI 72 ± 2时，使用Wilcoxon秩和检验，所有组间存在统计学显著差异（p < 0.05）。在THI 76 ± 2时，SLICK动物的A_I显著高于安格斯（p = 8.62 × 10^?5）和非SLICK（p = 9.84 × 10^?4）动物。使用Kruskal–Wallis检验，在每个牛组内的THI区间之间观察到统计学显著差异（安格斯：p = 0.0256，非SLICK：p = 6.06 × 10^?4，SLICK：p = 1.31 × 10^?10）。

瘤胃温度

为评估内部温度，使用Moonsyst螺栓记录瘤胃温度。总共收集并分析了15,059个数据点，THI范围为50.79–77.81。使用Shapiro–Wilks检验确定数据为非参数分布（p = 1.88 × 10^?7）。Kruskal–Wallis检验显示组间无统计学显著差异（p = 0.068）。Kendall’s tau等级相关分析显示所有组的瘤胃温度与THI存在弱负相关（安格斯：τ = ?0.173, p = 1.62 × 10^?69；非SLICK：τ = ?0.205, p = 7.20 × 10^?75；SLICK：τ = ?0.240, p = 2.57 × 10^?191）。对区间化瘤胃温度数据的Kruskal–Wallis检验显示，除THI 56 ± 2（p = 0.056）和THI 68 ± 2区间（p = 0.433）外，所有区间均存在统计学显著差异（p < 0.05）。在THI 72 ± 2时，安格斯牛的瘤胃温度显著高于非SLICK（p = 0.012）和SLICK（p = 0.025）复合牛。然而，在THI 76 ± 2时，安格斯牛的瘤胃温度仅显著高于SLICK复合牛（p = 0.007）。

HSP70表达分析

使用qPCR定量HSP70表达，靶向HSP70 mRNA，以GAPDH和TUBB为内参对照。收集基线和实验HSP70表达的ΔCt值，并比较它们之间的差异。通过Shapiro–Wilks检验确定ΔΔCt值为非参数分布（p = 7.21 × 10^?5）。安格斯牛的ΔΔCt中位数为?1.01 ± 3.46，非SLICK牛为0.470 ± 6.44，SLICK牛为?0.828 ± 5.01。从ΔΔCt计算个体HSP70表达倍数变化并分组。安格斯牛的倍数变化中位数为2.01 ± 6.33，非SLICK牛为0.722 ± 5.51，SLICK牛为1.78 ± 4.05。Kruskal–Wallis检验显示组间无差异（p = 0.506），Wilcoxon秩和检验证实了这一点（p > 0.05）。所有牛的HSP70表达倍数变化中位数为1.77 ± 5.99。基线收集和实验收集前一周的THI范围分别为39.74–76.80和53.09–76.82。基线收集和实验收集前平均峰值THI值分别为70.45 ± 4.11和74.72 ± 1.15。

讨论

为评估具有SLICK基因型的Senepol Red Angus × Galloway复合牛的耐热特性，研究人员评估了呼吸频率、活动水平和HSP70表达作为热应激耐受性的指标。研究发现，当THI水平升高时，具有SLICK基因型的复合牛与没有SLICK基因型的复合牛和安格斯对照相比，具有统计学上显著更低的呼吸频率和更高的活动水平。然而，在HSP70表达方面，未观察到牛组之间的显著差异。

呼吸频率增加是牛对热应激的已知生物学反应。从Kendall’s tau等级相关观察到的所有牛组呼吸频率与THI之间的统计学显著正相关证实了这一点。然而，在THI水平高于72时，具有SLICK基因型的牛的呼吸频率显著低于其他组，表明SLICK复合牛的热应变反应较低。值得注意的是，安格斯牛的呼吸频率总体最高，这表明对热应激的反应增强，这可能归因于它们的黑色被毛颜色。复合牛（包括SLICK和非SLICK）具有红棕色被毛颜色，并且呼吸频率显著低于安格斯对照。正如先前的研究所证明的，被毛颜色已知会影响牛的热负荷，因为增加了太阳辐射吸收，这很可能影响了安格斯和非SLICK复合牛之间观察到的差异。然而，与没有SLICK基因型的复合牛相比，具有SLICK基因型的复合牛呼吸频率显著更低，这表明具有SLICK基因型的牛对热应变的反应减弱。

先前观察到，暴露于长时间升高THI条件下的牛会保持静止，以减少动物运动期间代谢过程产生的内部热量。在THI 56 ± 2至68 ± 2范围内，观察到没有SLICK基因型的Senepol Red Angus × Galloway复合牛的活动指数（A_I）显著低于安格斯和SLICK复合牛。然而，未观察到安格斯和SLICK复合牛之间的A_I差异。相反，在THI 72 ± 2范围内，所有牛组之间观察到统计学显著差异，其中具有SLICK基因型的复合牛显示出最高的A_I。此外，在THI 76 ± 2范围内，SLICK复合牛的A_I显著高于安格斯和非SLICK复合牛。这些结果表明，当THI低于72 ± 2范围时，安格斯和SLICK复合牛在整个实验期间都很活跃。然而，在THI达到及超过72（热应变阈值）时，SLICK复合牛的A_I显著高于安格斯和非SLICK复合牛。在整个活动指数收集过程中，观察到安格斯牛的A_I与THI无相关性，而