CsYABBY1与CsMYB114通过介导黄酮类生物合成增强茶树获得性耐旱性

《Plant Biotechnology Journal》：CsYABBY1 and CsMYB114 Enhance Acquired Drought Tolerance by Mediating Flavonoid Biosynthesis in Camellia sinensis

本研究揭示了茶树（Camellia sinensis）通过中度干旱预适应（priming）获得增强耐旱性的分子机制。研究发现CsYABBY1和CsMYB114转录因子协同激活黄酮生物合成通路关键基因（CsCHS/CsCHI/CsFLS/CsDFR/CsANS/CsANR）表达，促进黄酮积累，通过增强ROS（活性氧）清除能力（如降低H2O2、MDA和·O2?水平）和维持光系统II效率（Fv/Fm）来提升获得性耐旱性。该研究为茶树抗旱育种提供了关键靶点和理论依据。

　　

1 引言

干旱是影响植物生长发育和生产力的关键环境胁迫因子。在全球气候变化背景下，气温升高和降水模式改变导致全球干旱事件更加频繁、剧烈和持久，这对主要栽培于热带和亚热带地区的茶树（Camellia sinensis）构成特殊挑战。干旱预适应（干旱 priming）已成为植物增强耐旱性的重要策略，这一过程通过预先暴露于中度胁迫诱导生理、代谢和遗传修饰，形成"胁迫记忆"机制，使植物对后续干旱事件能够作出更快速、更强烈的响应。

类黄酮作为一类具有6000多种化合物的苯丙烷衍生物，在植物抗旱中扮演重要角色，作为有效的抗氧化剂清除活性氧（ROS），减轻干旱胁迫诱导的氧化损伤。尽管研究表明类黄酮是植物抵抗干旱胁迫的关键代谢物，但类黄酮在茶树干旱胁迫特别是干旱预适应中的功能和转录调控机制尚不明确。

YABBY转录因子是植物特有的小型转录因子家族，包含N端C2C2锌指结构域和C端螺旋-环-螺旋结构域（YABBY结构域），最初被认为仅限于调节植物叶片极性建立和花器官发育，但近年研究发现YABBY在次级代谢特别是类黄酮生物合成和干旱胁迫响应中具有功能。R2R3-MYB转录因子是类黄酮生物合成的核心调控因子，其中MYB114属于亚组6（SG6）R2R3-MYB家族，能够直接结合类黄酮生物合成基因启动子区域并激活或抑制其表达。

2 结果

2.1 中度干旱预适应增强茶树获得性耐旱性

通过系统评估茶树在不同预适应强度下的生理参数和叶片解剖特征，发现中度干旱预适应相比非预适应对照赋予茶树更优异的耐旱性。重度干旱胁迫导致茶树叶片损伤、叶片相对含水量（LRWC）、叶绿素荧光和光系统II最大光化学效率（F_v/F_m）值降低，而丙二醛（MDA）、过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（·O₂^?）含量维持在较高水平。叶片解剖结构显示，中度干旱预适应后茶树叶片角质层厚度显著增加，而上表皮、栅栏组织、海绵组织、下表皮和叶肉厚度随干旱加剧而减少。

当经历不同强度干旱预适应的茶树面临第二轮干旱胁迫时，中度干旱预适应的茶树表现出更强的耐受能力，表现为更好的表型、较高的LRWC、叶绿素荧光和F_v/F_m值，以及较低的MDA、H₂O₂和·O₂^?含量。气孔开度分析表明，干旱预适应茶树在再次面临干旱胁迫时能更好地维持气孔功能。

2.2 类黄酮是干旱预适应中的关键印记代谢物

通过非靶向代谢组学分析，发现313个差异积累代谢物（DAMs），其中类黄酮代谢物占15.65%。在经历干旱预适应的茶树中，187个代谢物（包括64个上调DAMs）在再次面临干旱胁迫时积累水平更高，其中类黄酮占比最高（16.04%）。这些类黄酮代谢物在不同干旱胁迫程度下特异性积累，且主要在中度干旱胁迫下高度积累。

总黄酮含量测定表明，经历干旱预适应的茶树在再次面临干旱胁迫时类黄酮含量持续增加，而非预适应茶树则呈现先下降后上升的趋势。外源施用四种黄酮类化合物（表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、皂草苷和黄芪苷）显著改善了茶树在干旱胁迫下的表型，提高了叶绿素荧光和F_v/F_m值，降低了MDA、H₂O₂和·O₂^?含量，证实类黄酮在增强茶树耐旱性中的关键作用。

2.3 六个类黄酮生物合成基因的高表达导致预适应茶树类黄酮积累

转录组分析发现7760个差异表达基因（DEGs），KEGG富集分析显示类黄酮生物合成通路显著富集。125个DEGs被注释为苯丙烷生物合成相关基因，其中119个与类黄酮生物合成相关，84个基因在预适应茶树中表达更高。

类黄酮生物合成通量分析表明，经历重复干旱胁迫的茶树通过显著激活记忆基因进行转录重编程，导致类黄酮产量增加（尤其在C2-T2条件下）。六个类黄酮代谢物合成关键酶基因CsCHS（CsTGY09G0000882）、CsCHI（CsTGY01G0003643）、CsFLS（CsTGY04G0001430）、CsDFR（CsTGY02G0000792）、CsANS（CsTGY14G0001296）和CsANR（CsTGY08G0000373）在C2-T2中表达水平显著升高。qRT-PCR验证结果与转录组数据高度一致（Pearson相关系数R > 0.8）。

2.4 鉴定参与维持茶树获得性耐旱性的调控网络

通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建了六个类黄酮生物合成相关基因的共表达网络，发现35个转录因子与这些基因正相关（Pearson > 0.8），这些TF属于21个家族。启动子结合位点预测显示CsCHS、CsCHI、CsFLS、CsDFR、CsANS和CsANR的启动子含有至少13个TF的结合位点。

四个关键TF（CsbHLH [CsTGY01G0002824]、CsYABBY [CsTGY03G0002716]和两个CsMYBs [CsTGY15G0000202, CsTGY08G0001209]）在干旱预适应茶树中表达显著升高，特别是在第二轮干旱周期（C2-T2）中。qRT-PCR验证表明这四个TF基因在经历中度干旱预适应的茶树中表达更高。

进化树分析显示CsbHLH、CsYABBY和两个CsMYBs分别与AtbHLH18、AtYABBY1、AtMYB114和AtMYB91有最近的进化亲缘关系，因此将其命名为CsbHLH18、CsYABBY1、CsMYB114和CsMYB91。亚细胞定位证实这些TF定位于细胞核，转录激活分析表明它们具有转录激活活性。

2.5 过表达CsYABBY1和CsMYB114通过调控类黄酮生物合成增强茶树耐旱性和ROS清除能力

过表达CsbHLH18、CsYABBY1、CsMYB114和CsMYB91的茶树中，CsYABBY1-OE和CsMYB114-OE茶树的类黄酮含量极显著积累（p < 0.01）。在干旱胁迫下，CsYABBY1-OE和CsMYB114-OE茶树损伤较轻，表现出较高的叶绿素荧光和F_v/F_m值，以及较低的MDA、H₂O₂和·O₂^?含量。

基因表达分析显示，CsYABBY1过表达导致五个类黄酮生物合成基因（CsCHS、CsCHI、CsFLS、CsANS和CsANR）上调，而CsMYB114过表达导致六个基因（CsCHS、CsCHI、CsFLS、CsDFR、CsANS和CsANR）上调，表明这两个TF通过调控类黄酮生物合成增强茶树获得性耐旱性。

2.6 CsYABBY1和CsMYB114促进类黄酮生物合成基因表达

酵母单杂交（Y1H）实验表明CsYABBY1能够直接结合CsCHS、CsCHI、CsFLS、CsANS和CsANR基因启动子，而CsMYB114能够直接结合所有六个类黄酮生物合成基因启动子。双荧光素酶报告系统显示共表达35S::CsYABBY1与ProCsCHS::Luc、ProCsCHI::Luc、ProCsFLS::Luc、ProCsANS::Luc和ProCsANR::Luc，以及共表达35S::CsMYB114与所有六个基因启动子，均导致发光强度和林LUC/REN值显著增加。

分子对接显示CsYABBY1和CsMYB114能够有效结合类黄酮生物合成基因启动子区域，ΔⁱG值分别为-11.5至-19.6 kcal/mol和-15.6至-30.3 kcal/mol。EMSA实验进一步证实了CsYABBY1和CsMYB114与这些基因启动子的直接结合。

2.7 沉默CsYABBY1或CsMYB114降低茶树类黄酮含量和耐旱性

使用反义寡核苷酸（AsODN）技术沉默CsYABBY1和CsMYB114表达后，类黄酮生物合成基因表达显著降低，类黄酮含量显著减少。在干旱胁迫下，沉默植株遭受更严重的损伤，叶绿素荧光和F_v/F_m值显著降低，MDA、H₂O₂和·O₂^?含量显著增加，证实CsYABBY1和CsMYB114作为类黄酮生物合成的正调控因子增强茶树获得性耐旱性。

3 讨论

3.1 干旱预适应通过引发多级响应增强茶树获得性耐旱性

干旱预适应使茶树在再次面临干旱胁迫时表现出更强的耐旱能力，这一能力源于植物在多水平上相互连接的精细调控机制，包括形态、生理、代谢、转录、翻译甚至表观遗传水平的修饰。中度干旱预适应在茶树中留下深刻印记，使其在再次面临干旱胁迫时能够快速检索印记信息并作出更快响应。

代谢谱的显著变化和类黄酮化合物的高度积累表明，干旱预适应茶树保留了早期暴露于干旱胁迫的信息，使其在再次面临干旱时能够快速启动类黄酮合成相关基因，增强类黄酮合成和耐旱性。转录重编程事件，特别是类黄酮生物合成通路相关基因的上调，触发了保护性代谢物的积累，增强了茶树获得性耐旱性。

3.2 类黄酮是增强茶树获得性耐旱性的关键印记代谢物

类黄酮作为关键抗氧化剂，通过减少ROS诱导的氧化损伤在植物抗旱中发挥重要作用。经历干旱预适应的茶树在再次面临干旱胁迫时积累更多类黄酮，外源施用类黄酮显著缓解了干旱诱导的损伤。六个类黄酮结构基因的过表达显著增加了茶树类黄酮含量，减轻了ROS积累引起的氧化损伤，增强了耐旱性。

3.3 CsYABBY1/CsMYB114-类黄酮生物合成基因模块在增强茶树获得性耐旱性中起关键作用

CsYABBY1和CsMYB114被鉴定为参与茶树获得性耐旱性形成的关键转录因子，通过操纵类黄酮合成通路中六个枢纽基因的表达来调控类黄酮形成。这两个TF被证实能够直接结合启动子并激活类黄酮生物合成基因表达，过表达这些基因显著提高了类黄酮含量和类黄酮生物合成基因表达。

次级代谢物对植物在环境胁迫下的生存、协调和调控至关重要。CsYABBY1和CsMYB114作为核定位的转录激活因子，通过激活类黄酮生物合成基因促进类黄酮生物合成，从而增强抗氧化清除能力，降低氧化损伤，提高茶树获得性耐旱性。

4 材料与方法

研究使用生长良好且一致的1年生"铁观音"茶树材料，在福建农林大学温室中栽培。干旱处理分为对照组和处理组，通过系统测量干旱相关指标、叶片解剖结构观察、气孔分析、代谢组学分析、转录组测序、基因过表达、分子对接和蛋白质-DNA相互作用实验等方法，全面阐明了CsYABBY1和CsMYB114通过调控类黄酮生物合成增强茶树获得性耐旱性的分子机制。

所有实验均至少进行三次独立生物学重复，数据以平均值±标准差表示，通过GraphPad Prism 9.50分析，使用IBM SPSS Statistics 25.0软件进行方差分析（ANOVA）和Duncan多重范围检验统计显著性。