乳清蛋白源抗氧化肽的发现及其细胞保护机制研究

《Food Science & Nutrition》：Antioxidant Properties of Whey Protein-Derived Peptides: Radical Scavenging and Cytoprotective Effects

本文系统研究了乳清蛋白水解物(WPH)中抗氧化肽的活性，通过H-ORAC、DPPH和ABTS三种自由基清除实验筛选出8种活性肽（GYDTQ、GY、VY、DTDYKKY、WYS、WY、LDQW和YW），其中GYDTQ为新发现肽段。研究首次证实DTDYKKY、GYDTQ和LDQW等含天冬氨酸的肽段能通过非自由基清除机制显著提升C2C12成肌细胞在H2O2诱导的氧化应激下的存活率，为开发抗疲劳和抗衰老功能食品提供了新思路。

　　

ABSTRACT

乳清蛋白水解物富含具有潜在抗氧化特性的肽段，但具体序列的贡献尚未明确。本研究通过筛选具有高亲水性氧自由基吸收能力活性的组分，从WPH中鉴定出8种抗氧化肽。其中GYDTQ被确定为新型抗氧化肽。通过DPPH和ABTS自由基清除实验评估这些肽的抗氧化活性，结果显示所有八种肽均具有自由基清除活性：LDQW表现出最高的H-ORAC值，YW显示出最强的DPPH活性，而WYS则具有最高的ABTS活性。利用小鼠C2C12成肌细胞进行的细胞保护实验表明，DTDYKKY、GYDTQ、LDQW和WY能显著恢复过氧化氢诱导的氧化应激下的细胞活力，其中DTDYKKY效果最为显著。值得注意的是，GYDTQ虽表现出较低的自由基清除活性，但具有较高的细胞保护潜力，提示其可能存在替代性抗氧化机制。

1 引言

氧化应激会损害细胞和组织，导致衰老、癌症和心血管疾病等病症的发展。具有抗氧化能力的食物可以减轻动物和人类的氧化应激，可能改善疲劳和预防衰老。因此，抗氧化剂在维持健康方面发挥着重要作用。

抗氧化肽通过与自由基相互作用发挥其作用，有望有助于预防和治疗由氧化应激引起的各种疾病。抗氧化肽已在多种食物中被发现，包括鱼类、鸡蛋、大豆、谷物和牛奶。牛奶生物活性肽数据库总结了迄今为止发现的乳源生物活性肽（包括抗氧化剂）的信息。尽管已有关于乳蛋白水解物抗氧化活性的报道，但单个肽的具体特性仍未得到充分探索。

几种自由基清除测定法已被开发用于评估抗氧化能力。ORAC测定、DPPH自由基清除测定和ABTS自由基清除测定等常用于评估食物的抗氧化活性。这些测定在自由基种类和机制上有所不同，可能会根据测定条件影响观察到的活性。因此，有必要比较从多种自由基清除方法中获得的活动性。

除了进行自由基清除测定外，还应在培养细胞或体内评估抗氧化能力。分离自肌营养不良小鼠的C2C12细胞系被广泛用于研究肌肉分化和氧化应激。姜黄素和非瑟酮等食物来源的化合物已被证明可以恢复C2C12成肌细胞在过氧化氢诱导的氧化损伤后的活力，表明它们对肌肉损伤具有保护作用。因此，鉴定在氧化应激条件下能够恢复C2C12细胞活力的肽可能有助于开发用于预防肌肉萎缩和运动障碍的功能性成分。

本研究旨在通过比较体外多种抗氧化活性测定方法（包括基于细胞的测定）来鉴定乳清蛋白水解物中潜在的抗氧化肽。我们鉴定了八种具有自由基清除活性和对氧化应激具有细胞保护作用的抗氧化肽。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

WPH由森永乳业提供。其营养成分为78.2%蛋白质、0.4%脂肪、12.3%碳水化合物、5.1%灰分和4.0%水分。它由乳清蛋白浓缩物酶解而成，水解度为20.5%，通过凝胶渗透色谱法测定的平均分子量为448 Da。氨基酸组成通过质谱法测定。

细胞培养试剂和化学品购自富士胶片和光纯药株式会社。肽段GYDTQ、GY、VY、DTDYKKY、VL、WYS、WY、LDQW和YW购自BEX公司，纯度超过90%。

2.2 从WPH中分离具有高H-ORAC活性的肽段

使用高效液相色谱对WPH进行分级分离。将WPH溶解在超纯水中至浓度为10 mg/mL，然后通过0.22 μm膜过滤。随后将其注入Cadenza CD C18 HPLC柱。使用梯度洗脱法收集192个馏分。将干燥的样品稀释在10%乙腈中，并通过下述H-ORAC测定法进一步分析。

具有高H-ORAC活性的馏分使用HPLC进一步分离。这些馏分重新溶解在0.1% TFA溶液中，并上样到Cadenza CD C18柱上。使用梯度洗脱法对样品进行分级分离。根据色谱图中观察到的主要峰再次进行H-ORAC测定，并获得具有高H-ORAC活性的馏分。

2.3 使用液相色谱-质谱联用进行肽段鉴定

经过反复分级分离后，将表现出高H-ORAC活性的馏分进行液相色谱分析以分离肽段。将活性馏分重新溶解在超纯水中，并上样到ACQUITY UPLC BEH C18柱上。使用梯度洗脱法洗脱样品。

使用傅里叶变换质谱仪测定每个馏分中肽段的质量，并通过将其质量与乳清蛋白源肽段序列的质量进行比较来估计每个氨基酸序列。从NCBI蛋白质数据库检索乳清中主要蛋白质α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的氨基酸序列，计算酶解产生的肽段片段的理论分子量，并与观察到的全质谱结果进行比较。通过使用LC-MS/MS与相应的合成肽标准品进行比较来鉴定肽段。

全MS扫描在m/z 120-1800范围内进行。串联MS测量的参数如下：MS分辨率70,000，MS/MS分辨率17,500，鞘气流速45单位，辅助气流速10单位，喷雾电压3.5 kV，毛细管温度275°C，辅助气体加热器温度350°C。

2.4 H-ORAC测定

使用H-ORAC活性测定试剂盒进行测定。简要来说，将样品稀释在10%甲醇/水/乙酸溶液中，并与Trolox校准溶液或空白溶液一起加入孔中。然后加入荧光素和2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐。将溶液在96孔板中于37°C孵育。使用酶标仪每2分钟监测一次荧光（激发光485 nm，发射光530 nm），持续90分钟。通过从样品或标准的AUC中减去空白AUC来计算净曲线下面积。通过将净AUC与Trolox标准的AUC进行比较来确定每个样品的H-ORAC值。单位表示为μmol TE/g或μmol TE/μmol。

2.5 DPPH自由基清除测定

使用DPPH抗氧化测定试剂盒评估样品的DPPH自由基清除能力。简要来说，将20 μL样品加入每个孔中，然后加入80 μL测定缓冲液。随后加入100 μL DPPH工作溶液，将混合物在黑暗环境中于室温（25°C）孵育30分钟。使用酶标仪在517 nm处测量吸光度，结果以自由基清除活性的百分比表示。

2.6 ABTS自由基清除测定

使用抗氧化测定试剂盒进行测定。简要来说，将10 μL样品或Trolox校准溶液分配到孔中。然后依次加入10 μL肌红蛋白溶液和150 μL发色剂溶液。通过加入40 μL 441 μM H₂O₂工作溶液启动反应。用塑料薄膜密封板，在室温下反应5分钟。使用酶标仪在405 nm处测量吸光度。净吸光度通过减去空白吸光度计算，并以mM TE/mM肽表示为Trolox当量。

2.7 细胞培养

C2C12小鼠成肌细胞系购自ECACC。细胞在含有10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中维持。随后将细胞在37°C、湿润的含有5% CO₂的气氛中孵育。当达到约80%汇合度时，将细胞传代至新的培养皿中。

2.8 细胞活力测定

按照报道的程序评估C2C12成肌细胞的细胞活力，并根据实验条件稍作修改。将C2C12成肌细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并孵育24小时。孵育后，用不含FBS和青霉素/链霉素的DMEM冲洗细胞。随后将样品加入培养物中，并将细胞再孵育24小时。接下来，加入不同浓度的H₂O₂，并将细胞孵育1小时。随后再次冲洗细胞，并使用CCK-8评估细胞活力。具体来说，将培养基加入冲洗过的孔中，然后加入1% CCK-8溶液。孵育2小时后，使用酶标仪在450 nm处测量吸光度。细胞活力使用以下公式确定：细胞活力 (%) = (OD_样品 - OD_空白) / (OD_对照 - OD_空白) × 100%，其中OD指光密度。

2.9 统计分析

为确定对照组和处理组之间差异的显著性，使用Student's t检验或单因素方差分析（ANOVA）后进行Dunnett检验分析数据。数据表示为平均值±标准差。所有统计分析均使用SPSS Statistics版本29.0进行。

3 结果

3.1 WPC和WPH中H-ORAC活性的评估

进行H-ORAC测定以评估样品的抗氧化活性。WPC的H-ORAC值为110.74 ± 7.17 μmol TE/g，而WPH的更高，为308.22 ± 33.82 μmol TE/g。这表明WPH比WPC具有更高的抗氧化活性，这归因于WPH中肽段的抗氧化特性。

3.2 WPH肽段中H-ORAC活性的评估

我们鉴定了WPH中比WPC具有更高H-ORAC值的抗氧化肽。使用疏水相互作用HPLC对WPH进行分级分离，并测定了在5至69分钟之间收集的192个馏分的H-ORAC值。七个馏分（按保留时间递增顺序指定为Fr.1–Fr.7）具有显著高的H-ORAC值。这七个馏分中的每一个都使用HPLC进一步分级分离，并获得具有高H-ORAC活性的馏分。对于每个馏分，使用LC-MS鉴定了最主要的碎片离子，并进行了MS/MS分析。从Fr.1–Fr.7的主要碎片离子中鉴定出以下抗氧化肽候选物：来自Fr.1的GYDTQ和GY；来自Fr.2的VY；来自Fr.3的DTDYKKY；来自Fr.4的VL；来自Fr.5的WYS；来自Fr.6的WY；以及来自Fr.7的LDQW和YW。

3.3 WPH中肽段的H-ORAC测定

使用H-ORAC测定法测定了WPH中肽段的抗氧化活性。八种肽段GYDTQ、GY、VY、DTDYKKY、WYS、WY、LDQW和YW显示出比GSH更高的H-ORAC活性。在这八种肽中，LDQW显示出最高的H-ORAC值。肽段VL未表现出H-ORAC活性。

3.4 WPH肽段的DPPH和ABTS自由基清除测定

对于表现出高H-ORAC活性的八种肽段，进行了额外的自由基清除测定，包括DPPH和ABTS自由基清除测定。在DPPH自由基清除测定中，肽段YW表现出最高的活性，自由基清除率为22.45% ± 1.75%，其次是WY、LDQW、WYS、DTDYKKY、VY、GY和GYDTQ。在ABTS自由基清除测定中，肽段WYS表现出最高的活性，为1.29 ± 0.06 mM TE/mM肽，其次是DTDYKKY、WY、YW、GY、VY、LDQW和GYDTQ。所有在H-ORAC测定中表现出自由基清除活性的八种肽段在DPPH和ABTS测定中也显示出活性。H-ORAC和DPPH自由基清除测定结果显示出相似的趋势，前五种肽段在两种测定中均显示出最高的活性。ABTS自由基清除测定结果显示出与H-ORAC和DPPH自由基清除测定结果不同的趋势。在ABTS自由基清除测定中，WYS和DTDYKKY表现出相对较高的活性。此外，在H-ORAC和DPPH自由基清除测定中显示低值的GY，其活性与在H-ORAC和DPPH自由基清除测定中显示较高值的WY和YW相当。

3.5 WPH源肽段对氧化应激的细胞保护作用评估

我们研究了八种已确认具有自由基清除活性的WPH源肽段对C2C12成肌细胞活力的影响。首先，我们评估了浓度高达1000 μM的H₂O₂对C2C12细胞的影响。在800和1000 μM浓度下，细胞活力显著降低。剂量反应实验表明，用800 μM H₂O₂处理导致约60%的细胞活力。这一活力水平与先前的研究一致，因此，本研究采用800 μM作为诱导氧化应激的H₂O₂最佳浓度。在遭受H₂O₂诱导氧化应激的C2C12成肌细胞中，与对照组相比，GYDTQ、DTDYKKY、WY和LDQW显著提高了细胞活力，其中DTDYKKY具有最高的活力恢复效果。即使是具有较低自由基清除活性的肽段，包括新型肽段GYDTQ，也提高了细胞活力。这表明这些肽段通过自由基清除活性以外的机制发挥其保护作用。

4 讨论

在本研究中，我们通过进行各种自由基清除测定和评估C2C12成肌细胞活力的变化，鉴定了几种WPH的抗氧化肽。发现WPH比WPC具有更高的H-ORAC值。使用HPLC鉴定了具有最高H-ORAC活性的馏分，并通过LC-MS/MS鉴定了WPH的抗氧化肽。这些肽段在DPPH和ABTS自由基清除测定以及H-ORAC测定中均具有活性，并显示出细胞保护作用。虽然其中有一些已知序列，但发现了一个新序列GYDTQ。

肽段的抗氧化特性主要归因于其氨基酸序列。酪氨酸、色氨酸、组氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和赖氨酸是生物活性肽抗氧化能力的重要决定因素。本研究中获得的肽段必须含有Tyr或Trp残基，因为H-ORAC测定检测Tyr和Trp的抗氧化活性。在鉴定出的肽段候选物中，VL未显示H-ORAC活性。在含有VL的Fr.4的LC-MS/MS分析中，除了VL的峰外还观察到几个峰，表明该活性是由于含有高抗氧化能力氨基酸（包括Tyr或Trp）的序列混合物所致。

本研究比较了三种自由基清除测定（H-ORAC、DPPH和ABTS）的结果。对于八种鉴定出的抗氧化肽，H-ORAC和DPPH自由基清除测定显示出相似的趋势，而ABTS自由基清除测定显示出不同的趋势。虽然DPPH和ABTS自由基清除测定是相似的评估方法，但自由基清除活性取决于抗氧化剂的极性，DPPH与疏水性物质反应，而ABTS与亲水性和亲脂性物质都反应。ABTS自由基清除测定的特点是反应时间短，先前的研究报道反应速度可能因样品而异。因此，显示出相对较高ABTS自由基清除活性的WYS和DTDYKKY被认为是具有快速反应性的肽段。我们假设这种肽段特性影响了本研究中测定结果之间的差异。这也表明需要结合多种自由基清除测定而不是使用单一方法。

在本研究中，我们鉴定了八种抗氧化肽。肽段GYDTQ是新发现的，目前没有证据支持其抗氧化活性或任何其他生物学功能。GYDTQ在三种自由基清除测定中显示出八种抗氧化肽中最低的抗氧化活性；然而，它在C2C12细胞中提供了第二高的氧化应激保护。这表明GYDTQ通过除自由基清除之外的另一种机制发挥其抗氧化作用。连同新型抗氧化肽GYDTQ，本研究首次证明DTDYKKY和LDQW可以在氧化应激条件下保护细胞。值得注意的是，显示出最强细胞保护作用的三种肽段——DTDYKKY、GYDTQ和LDQW——共享一个共同的结构特征：天冬氨酸残基的存在。细胞内抗氧化机制的一个例子是激活Keap1-Nrf2信号通路。Keap1的Kelch结构域含有带正电荷的残基，例如精氨酸，它们与Nrf2的带负电区域发生静电相互作用。先前的研究表明，抗氧化肽可以结合Keap1，从而抑制其与Nrf2的结合并发挥抗氧化作用。这种相互作用增加了细胞内抗氧化酶（谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶）的活性。鉴于DTDYKKY、GYDTQ和LDQW这三种表现出高细胞保护作用的肽段含有天冬氨酸残基，这些序列很可能与带正电荷的Keap1 Kelch结构域发生静电相互作用，并有助于其在氧化应激下观察到的保护作用。除了Nrf2-Keap1通路外，其他信号级联——包括线粒体依赖性凋亡通路、TGF-β/SMAD、AMPK/SIRT1/PGC-1α、PI3K/Akt/mTOR和NF-κB通路——也可能被涉及。需要进一步的研究来确定抗氧化肽对成肌细胞的影响。

总之，我们展示了WPH源肽段的自由基清除作用和对C2C12细胞的保护作用。其中，我们鉴定了一种新型GYDTQ肽。由于氧化应激是多种病症的原因，包括衰老、心血管疾病和抑郁症，抗氧化剂的应用潜力巨大。虽然需要进一步的研究来确定WPH及其鉴定出的肽段在动物模型和人类队列中的确切效果，但目前的发现支持它们作为有效抗氧化剂的潜力。本研究中鉴定的肽段表明在开发用于氧化应激相关疾病的肽基治疗剂方面具有潜在应用，以及在配制含有富含这些肽段的食物蛋白水解物的功能性食品和补充剂以缓解疲劳和抗衰老方面具有潜力。