冬虫夏草活性成分虫草素通过靶向HRD1介导PD-L1泛素化降解增强抗结直肠癌免疫治疗

《MedComm》：Cordycepin Targets HRD1 to Promote Cancer Cell PD-L1 Ubiquitin–Proteasome Degradation and Increase Antitumor Immunity

本研究发现冬虫夏草（Cordyceps militaris）提取物（CME）及其关键活性成分虫草素（Cordycepin, COR）能显著下调结直肠癌细胞程序性死亡配体1（PD-L1）表达。机制研究表明，COR特异性靶向E3泛素连接酶HRD1，通过泛素-蛋白酶体途径促进PD-L1蛋白降解，从而阻断PD-1/PD-L1免疫检查点通路，增强CD8+ T细胞介导的肿瘤杀伤作用。动物实验证实COR单药疗效与抗PD-1疗法相当，且与抗CTLA-4抗体联用具有协同增效作用，为结直肠癌免疫治疗提供了新型小分子药物策略。

　　

冬虫夏草提取物及其活性成分虫草素对PD-L1表达的调控作用

研究团队发现，冬虫夏草提取物（CME）能够以浓度和时间依赖的方式，显著降低结直肠癌细胞系（如HCT116和RKO）中总PD-L1蛋白及细胞膜表面PD-L1的表达水平。这一现象在肺癌细胞H1975和胰腺癌细胞SU86.86中也得到验证，提示CME对PD-L1的下调作用可能具有广谱性。通过活性追踪分离技术，研究人员确定虫草素（COR）是CME中发挥PD-L1下调作用的关键活性分子。进一步的实验证实，COR同样能剂量依赖性和时间依赖性地降低结直肠癌细胞中PD-L1的蛋白水平，且在其有效浓度范围内对正常肠上皮细胞及癌细胞本身无明显细胞毒性。

虫草素增强T细胞活性及抗肿瘤免疫效应

为评估COR的功能影响，研究进行了体外T细胞杀伤实验。将过表达PD-1的Jurkat T细胞与结直肠癌细胞共培养，发现COR处理能显著增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。在构建的MC38小鼠结直肠癌皮下移植瘤模型中，COR治疗能有效抑制肿瘤生长，并呈现剂量依赖性。重要的是，在免疫缺陷的裸鼠模型中，COR的抗肿瘤效应消失，表明其作用依赖于完整的免疫系统，特别是T细胞功能。对小鼠肿瘤组织的分析显示，COR治疗增加了肿瘤内CD8⁺ T细胞的浸润和活化标志物颗粒酶B（GzmB）的表达，同时减少了免疫抑制性的调节性T细胞（Treg细胞）和髓源性抑制细胞（MDSCs）的数量，表明COR能有效改善肿瘤免疫微环境。

虫草素通过泛素-蛋白酶体途径降解PD-L1的分子机制

机制探索表明，COR并不影响PD-L1的mRNA转录水平，而是通过促进PD-L1蛋白的降解来发挥作用。使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）进行的实验显示，COR显著缩短了PD-L1蛋白的半衰期。当使用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞时，COR诱导的PD-L1降解被有效阻断，而溶酶体抑制剂氯喹（CQ）则无此效果，证明COR主要通过泛素-蛋白酶体途径降解PD-L1。进一步的免疫共沉淀实验直接证实COR处理能增强PD-L1的多聚泛素化水平。通过蛋白质组学分析和基因敲低技术，研究将目标锁定在E3泛素连接酶HRD1（HMG-CoA reductase degradation protein 1）上。敲低HRD1可逆转COR对PD-L1的下调作用，而免疫共沉淀实验也证实了HRD1与PD-L1之间存在直接的相互作用。

虫草素直接靶向E3连接酶HRD1

为验证COR与HRD1的直接结合，研究人员采用了细胞热位移分析（CETSA）和微量热泳动（MST）技术。CETSA结果显示COR能增强HRD1的热稳定性，表明两者存在结合。MST分析进一步定量测定了COR与HRD1的结合亲和力。分子对接模拟预测COR可能与HRD1蛋白的Arg39残基发生关键相互作用。通过构建HRD1的Arg39点突变体并进行MST验证，发现该突变确实削弱了COR与HRD1的结合，从而确定了COR的作用靶点。功能回复实验表明，在HRD1敲低的细胞中，COR增强T细胞杀伤肿瘤细胞的能力被取消，而过表达HRD1则不能进一步增强COR的效应，明确了HRD1是COR发挥作用所必需的分子靶标。

虫草素与抗CTLA-4抗体的协同抗肿瘤效应

基于COR通过降解PD-L1阻断PD-1/PD-L1通路，而抗CTLA-4抗体通过不同机制激活T细胞，研究者探索了二者联合使用的效果。在MC38小鼠模型中，COR单药治疗显示出与抗PD-1单药治疗相当的抗肿瘤效果。更重要的是，COR与抗CTLA-4抗体联合治疗产生了显著的协同效应，肿瘤抑制效果远优于任一单药治疗。流式细胞术分析联合治疗组小鼠肿瘤组织发现，该组肿瘤微环境中免疫抑制性的Treg细胞和MDSCs比例最低，而细胞毒性T细胞的活性标志GzmB水平最高，说明联合治疗能更有效地逆转免疫抑制状态，激活抗肿瘤免疫应答。

HRD1与PD-L1在结直肠癌临床样本中的相关性分析

对临床结直肠癌患者组织样本的分析显示，在癌旁正常组织中HRD1表达较高，而在癌组织中PD-L1表达水平上调，两者表达呈负相关趋势。生物信息学分析利用公共数据库（如Kaplan-Meier plotter, TIMER 2.0）发现，在结直肠癌患者中，低HRD1表达合并高PD-L1表达与较差的预后相关。此外，HRD1表达水平与肿瘤内CD8⁺ T细胞等免疫细胞的浸润程度呈正相关，并且在微卫星高度不稳定（MSI-H）型结直肠癌中，PD-L1表达更高，进一步提示HRD1介导的PD-L1降解在肿瘤免疫调控和临床预后中可能扮演重要角色。

结论与展望

该研究系统阐明了传统中药冬虫夏草活性成分虫草素（COR）作为一种新型小分子免疫检查点调节剂的作用机制：通过直接靶向E3泛素连接酶HRD1，促进肿瘤细胞表面免疫检查点蛋白PD-L1的泛素化降解，从而解除其对T细胞的抑制，增强机体抗肿瘤免疫力。研究不仅揭示了COR的单药疗效，还证明了其与现有免疫检查点抑制剂（如抗CTLA-4抗体）联用的协同潜力。这一发现为开发源于天然产物的小分子PD-L1降解剂提供了新的思路和实验依据，有望为结直肠癌及其他恶性肿瘤的免疫治疗提供新的策略和药物候选。