呼出一氧化碳可作为牙周治疗后龈下菌群持续失调的监测指标

《JOURNAL OF CLINICAL PERIODONTOLOGY》：Exhaled Carbon Monoxide Indicates Persistent Subgingival Dysbiosis After Periodontal Therapy

本研究通过2年随访发现，呼出一氧化碳（CO）水平与牙周非手术治疗（NSPT）后吸烟者龈下微生物群失调存在剂量依赖性关联。研究采用16S rRNA基因测序技术，发现吸烟者呼出CO每增加10 ppm，以梭杆菌属（Fusobacterium）和普雷沃菌属（Prevotella）为主的厌氧菌群丰度增加16%（95% CI: 8%-26%），表明CO可能作为牙周治疗后持续菌群失调的环境选择因子。

　　

研究背景与目的

牙周炎是成人牙齿丧失的主要原因之一，其特征是牙齿支持组织的破坏。这种疾病主要由宿主对龈下微生物群失调的免疫反应所驱动。吸烟是影响牙周炎发生和发展的最重要行为因素之一。吸烟者患牙周炎的风险更高，疾病进展也更严重。吸烟不仅影响牙周临床参数，如牙周袋深度和附着丧失，还对龈下微生物组的组成产生深远影响。

一氧化碳（CO）是一种无色无味的气体，高浓度时具有毒性，但也可通过血红素加氧酶介导的血红素降解内源性产生，微生物也能少量产生。在口腔中，CO既可来自外部来源（如烟草烟雾），也可通过组织代谢内源性产生。目前尚不清楚口腔细菌是否积极代谢CO，将其作为能源，或对其进行酶促转化或解毒，也不清楚呼出的CO是否可以作为牙周治疗期间吸烟者和非吸烟者龈下菌群失调的指标。

因此，本研究旨在调查接受非手术牙周治疗（NSPT）的吸烟和非吸烟牙周炎患者中，CO对龈下微生物组的剂量依赖效应，并进行为期2年的随访。研究使用Smokerlyzer设备客观测量呼出CO，并分析其对微生物组成的影响。

材料与方法

本研究是对ABPARO试验数据的二次分析。ABPARO试验是一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照、平行分组、IV期疗效研究，在德国八所大学医院进行，旨在评估辅助使用抗生素对非手术牙周治疗的长期影响。该研究纳入了345名年龄在18-75岁之间、诊断为未经治疗的局部到广泛性III-IV期牙周炎的患者。

本次分析随机抽取了符合方案集的163名受试者作为子样本，其中69人经问卷确认为吸烟者，94人为非吸烟者。在基线（V2）、治疗后2个月（V4）、14个月（V8）和26个月（V12）测量呼出CO浓度。使用Bedfont Micro 4 Smokerlyzer设备测量CO浓度，单位为ppm。从每位参与者的四颗牙齿（每象限一颗）收集龈下菌斑样本。使用16S rRNA基因测序技术分析微生物组。

统计分析方面，使用线性回归模型检验CO测量值对龈下微生物失调的影响，并调整年龄、性别和治疗组的混杂因素。为了解吸烟者中微生物群对呼出CO的集体反应，使用潜在狄利克雷分配（LDA）方法开发了一个多微生物标记，以识别与CO水平共同变化的多微生物集群。采用零膨胀负二项混合效应模型检查CO水平与多微生物标记丰度之间的关联。

研究结果

基线数据分析显示，自我报告的吸烟状况是一个强有力的指标，吸烟者的CO值显著高于非吸烟者。CO读数随年龄变化，年龄较大的组测量值逐渐降低。C级患者的平均CO值显著高于B级患者。

随时间变化的分析表明，吸烟者的CO水平在治疗后14个月和26个月时较基线显著下降。而非吸烟者在所有研究访视中均未观察到CO测量的统计学显著变化。

线性模型显示，在牙周治疗前，CO测量值与菌群失调之间无显著关联。然而，在NSPT后，CO水平与菌群失调呈正相关，这种效应持续到治疗后26个月。

敏感性分析显示，在所有访视中，仅包含吸烟状态的模型比仅包含CO的模型始终具有更低的Akaike信息准则（AIC）和更高的解释方差（R²）。将两个预测因子结合仅产生边际的R²增益。

针对吸烟者的分层分析发现，LDA模型识别出一个独特的与呼出CO水平共同变化的多微生物集群。这个CO相关集群在26个月的随访期内表现出一致的时间模式，CO暴露与集群丰度在所有时间点均呈持续正相关。该多微生物CO集群以厌氧菌属为主，包括梭杆菌属（约40%载荷）和普雷沃菌属（约25%载荷）。零膨胀负二项混合效应模型显示，在调整年龄、性别、牙周袋探诊深度（PPD）、菌斑指数和抗生素治疗后，CO每增加10 ppm，多微生物标记的丰度显著增加（β = 1.16；95% CI: 1.08–1.26）。

讨论

本研究结果表明，在接受NSPT的吸烟和非吸烟混合人群中，呼出CO水平是龈下菌群失调的补充指标。这在吸烟者中发现的由厌氧性梭杆菌和普雷沃菌主导的CO依赖性多微生物集群得到了支持。

本研究在几个方面具有独特性，包括样本量、纵向设计以及应用16S rRNA基因测序进行微生物组分析。据我们所知，尚无其他研究在2年期间检查牙周炎患者的龈下微生物组样本，特别是关注CO对龈下微生物失调的剂量依赖效应。

识别出一个由厌氧菌属主导的独特的CO相关多微生物集群，为CO作为龈下微生物组环境选择因子的作用提供了新的证据。这与吸烟者中报告的菌门水平模式一致，包括变形菌门的减少和含有专性厌氧菌的厚壁菌门和放线菌门的富集。我们的发现与新兴的理解相一致，即CO作为一种生态过滤器，通过多种相互关联的机制改变牙周袋内的竞争生态系统。CO与血红蛋白的亲和力是氧气的250倍，这引发了一系列环境变化，有利于我们识别的特定微生物集群。在吸烟者的牙周袋中，这种优先结合导致相对组织缺氧，创造了专性厌氧菌可能胜过其需氧对应物的条件。这种缺氧环境直接解释了为什么我们的多微生物标记由严格厌氧菌属主导。此外，CO通过结合其呼吸链中的血红素和金属酶，对需氧细菌产生直接抑制作用。这种机制产生了一种选择压力，即对厌氧物种亚毒的CO浓度对需氧共生菌变得抑制。由此产生的微生物选择过程可能有利于耐CO的多微生物集群。

敏感性分析显示，基线自我报告的吸烟状况是比单独呼出CO测量更强大、更简约的菌群失调预测指标，表明CO和吸烟状况捕捉了烟草暴露的不同方面。

研究中一些非吸烟者的CO水平高于5 ppm。对这些升高水平的可能解释包括被动吸烟、环境暴露于CO以及食用某些影响呼出气中氢气水平的食物。Bedfont Smokerlyzer建议了几个区分非吸烟者、临界吸烟者和不同成瘾程度吸烟者的临界值。这些临界值范围从非吸烟者的0到6 ppm，到非常重度吸烟者的>35 ppm。其他文献建议的临界值范围在3到8 ppm之间。这一观察结果支持了口腔细菌可能产生CO，从而人为抬高测量值的推测。

局限性包括CO的半衰期较短（约4.5小时），如果未考虑最后一支烟的吸烟时间，可能会引入偏倚，尤其是在不频繁吸烟者中。检测吸烟状况的金标准是测量血浆、唾液或尿液中的可替宁，与CO相比具有更高的敏感性和特异性。然而，出于临床目的，CO测量因其非侵入性、易于使用和快速出结果而更实用。此外，研究未询问每日吸烟支数和吸烟年限。由于采用短读长测序方法，无法在物种水平上可靠地分析微生物组，这种有限的分辨率可能掩盖了与菌群失调或CO水平的物种特异性关联。

结论

本分析证明，CO是菌群失调的补充指标，也是龈下微生物组中潜在的环境选择因子，它创造了有利于由梭杆菌和普雷沃菌主导的独特厌氧微生物集群建立和持续存在的条件。这种机制性理解解释了牙周病在吸烟者中临床持续存在的原因，并为制定针对性的治疗干预措施提供了框架，这些措施同时解决微生物失调和导致疾病进展的环境因素。