DNAJB11-SDF2/SDF2L1复合物调控多囊蛋白1切割的分子机制

《Journal of Biomechanics》：Variations in knee compressive force profiles in patients with osteoarthritis: the absence of the first peak in knee compressive force during walking

本研究聚焦于DNAJB11相关肾病中多囊蛋白1（PC1）成熟障碍的分子机制。研究人员通过相互作用蛋白质组学筛选，发现SDF2和SDF2L1是DNAJB11的关键相互作用蛋白，三者形成功能复合体，其表达水平相互依存，共同调控PC1的GPS位点切割。该复合物的缺失导致PC1加工异常，揭示了常染色体显性多囊肾病（ADPKD）样病理的新机制，为理解DNAJB11功能及其相关疾病提供了重要见解。

　　

在生命科学的精密世界里，蛋白质的正确折叠和加工是维持细胞功能的基础，任何环节的失误都可能引发连锁反应，导致疾病发生。常染色体显性多囊肾病（ADPKD）就是一种典型的例子，患者肾脏中会出现大量充满液体的囊肿，最终导致肾功能衰竭。这种疾病与PKD1基因编码的多囊蛋白1（PC1）功能失常密切相关。PC1是一种大型膜蛋白，其在内质网（ER）中的成熟过程十分复杂，需要经过精确的GPS（G蛋白偶联受体蛋白水解位点）自切割。近年来，科学家们发现一种名为DNAJB11的分子伴侣的突变也会引起类似ADPKD的肾病，表现为肾脏囊肿和肝功能异常。DNAJB11是一种内质网驻留的Hsp40共伴侣蛋白，已知其对于PC1的正确加工至关重要，但其具体的工作机制，尤其是它是否与其他蛋白质协同作用来完成这一任务，尚不明确。为了解决这个问题，由Tilman Busch、Bj?rn Neubauer等研究人员组成的团队开展了深入研究，他们的成果发表在《Journal of Biological Chemistry》上。

为了揭示DNAJB11的作用机制，研究人员运用了几项关键技术。他们首先通过免疫共沉淀结合液相色谱-质谱联用（IP-MS）技术，从肾小管上皮细胞（IMCD3）中筛选内源性DNAJB11的相互作用蛋白。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，他们构建了Dnajb11、Sdf2、Sdf2l1的单基因以及Sdf2; Sdf2l1双基因敲除（KO）细胞系，并利用同源重组技术构建了内源性C端携带V5标签的PC1细胞模型，以便精确分析PC1的切割情况。通过免疫共沉淀（Co-IP）和免疫印迹（Western Blot）实验，他们在细胞系和小鼠胚胎组织中验证了蛋白质间的相互作用和表达水平。此外，还通过实时定量PCR（RT-qPCR）分析了基因转录水平，并通过在培养基中免疫沉淀DNAJB11来探究其分泌情况。

Identification of DNAJB11-interacting proteins

研究人员首先旨在揭示DNAJB11的相互作用网络。他们通过免疫共沉淀技术从野生型（WT）和Dnajb11基因敲除（KO）的IMCD3细胞中分离内源性DNAJB11，并进行质谱分析。结果发现，有20个蛋白质与DNAJB11特异性结合，其中基质细胞衍生因子2（SDF2）及其同源物SDF2L1的富集程度最高。这一相互作用在HEK293T细胞的重组表达实验以及小鼠胚胎组织的内源性免疫共沉淀中均得到了证实。有趣的是，在Dnajb11^-/-小鼠胚胎和Dnajb11 KO细胞中，SDF2和SDF2L1的蛋白质水平显著降低，而它们的mRNA水平并未变化，提示这种调控发生在蛋白质层面。

SDF2 and SDF2L1 protein levels are reduced after loss of DNAJB11

为了确认上述发现，研究团队在IMCD3 Dnajb11 KO细胞中进行了验证。免疫印迹结果显示，与野生型相比，KO细胞中的SDF2和SDF2L1蛋白水平确实大幅下降。而当在KO细胞中重新表达DNAJB11后，SDF2和SDF2L1的水平得以恢复。进一步研究表明，这种蛋白水平的下降并非由于转录抑制或蛋白酶体、溶酶体降解途径的增强所致。

DNAJB11 protein levels are reduced after loss of SDF2 and SDF2L1

那么，反过来SDF2和SDF2L1是否影响DNAJB11呢？研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了Sdf2 KO、Sdf2l1 KO以及Sdf2; Sdf2l1双敲除（DKO）的IMCD3细胞系。结果发现，单个基因的敲除会使DNAJB11蛋白水平降低约50%，而双基因敲除则导致DNAJB11蛋白几乎完全消失。在DKO细胞中重新表达SDF2或SDF2L1，都能使DNAJB11的蛋白水平恢复正常。这表明DNAJB11与SDF2/SDF2L1的蛋白表达水平是相互依赖的。

DNAJB11 is secreted into the extracellular space in Sdf2; Sdf2l1 double knockout cells

为什么在SDF2/SDF2L1缺失时，DNAJB11的蛋白水平会下降？RT-qPCR分析显示，在DKO细胞中，Dnajb11的转录水平反而升高，排除了转录抑制的可能性。一个关键的线索在于，DNAJB11本身不含内质网滞留信号，而SDF2和SDF2L1的C端具有典型的KDEL内质网滞留 motif。研究人员推测，DNAJB11可能通过与SDF2/SDF2L1的结合而滞留于内质网。实验证实，在DKO细胞的培养基中，DNAJB11的含量远高于野生型细胞。更重要的是，在DKO细胞中表达野生型DNAJB11无法恢复其细胞内浓度，但表达一个附加了KDEL信号（DNAJB11_KDEL）的突变体则能使细胞内DNAJB11水平显著升高甚至超过野生型。这证明SDF2和SDF2L1对于将DNAJB11锚定在内质网中至关重要，缺失它们会导致DNAJB11被大量分泌到细胞外。

Loss of Sdf2 and Sdf2l1 leads to impaired PC1 processing

接下来，研究核心问题是：SDF2/SDF2L1的缺失是否影响DNAJB11的关键功能——PC1的加工？通过免疫沉淀检测内源性V5标签标记的PC1，研究人员发现，Sdf2或Sdf2l1的单基因敲除并不影响PC1的GPS切割（CTF/FL比值正常）。然而，在Sdf2; Sdf2l1双敲除细胞中，PC1的切割被严重抑制，其切割产物C末端片段（CTF）与全长蛋白（FL）的比值显著降低。利用识别PC1 N末端的抗体进行检测，也证实了双敲除细胞中未切割的全长PC1比例增加。这一缺陷在重新表达SDF2或SDF2L1后得到挽救。

SDF2 or SDF2L1 are essential for DNAJB11-mediated PC1 processing

一个关键的问题是：PC1加工缺陷在DKO细胞中是由于DNAJB11的缺失，还是SDF2/SDF2L1本身具有不可或缺的功能？为了回答这个问题，研究人员在DKO细胞中表达了能滞留于内质网的DNAJB11_KDEL蛋白。尽管此时细胞内DNAJB11蛋白水平恢复正常，但PC1的切割缺陷并未得到改善。这表明，即使DNAJB11存在于内质网中，如果缺乏SDF2或SDF2L1，它也无法有效执行其促进PC1切割的功能。

SDF2 and SDF2L1 require DNAJB11 for PC1 cleavage

反之，在Dnajb11 KO细胞中，即使同时过表达SDF2和SDF2L1，也无法挽救PC1的切割缺陷。这证明SDF2/SDF2L1的功能依赖于DNAJB11的存在。

综上所述，本研究揭示了DNAJB11、SDF2和SDF2L1形成一个功能性的共伴侣复合体。该复合体的稳定性依赖于各组分间的相互作用：SDF2/SDF2L1通过其内质网滞留信号防止DNAJB11被分泌，从而维持其细胞内浓度；而DNAJB11对于维持SDF2/SDF2L1的蛋白稳定性也至关重要。最重要的是，该复合体作为一个整体，而非单个组分，是确保PC1进行正确GPS切割所必需的。这一发现不仅阐明了DNAJB11相关肾病中PC1成熟障碍的具体分子途径，将SDF2和SDF2L1确立为DNAJB11功能的关键辅助因子，也为理解内质网中复杂蛋白质的加工质量控制提供了新的视角。由于SDF2和SDF2L1在功能上存在冗余，单独缺失其中一个不会引起表型，这或许解释了为何尚未发现由SDF2或SDF2L1突变直接引起的人类遗传性肾病，但它们可能作为ADPKD的遗传修饰因子影响疾病进程。未来研究将进一步探索该复合体是否也调控其他客户蛋白的加工，以及在体缺失这些蛋白是否确实能模拟DNAJB11缺失的表型。