利用膜定位肽的无细胞靶向脂质体定向生产技术

《Journal of Contextual Behavioral Science》：Cell-free production of target-directed liposomes utilizing membrane localization peptides

本文介绍了一种创新方法，通过无细胞蛋白质合成（CFPS）技术与膜定位肽（MLPs）相结合，实现亲水性蛋白（如纳米抗体）在脂质体膜上的共翻译定向定位。该方法绕过了传统化学偶联的多步骤过程，为快速制备功能化脂质体（如病毒样颗粒、RNA疗法载体）提供了高效、高通量且低污染的平台，在药物递送和靶向治疗领域具有重要应用前景。

　　

Highlight

利用无细胞系统共翻译生产膜定位肽（MLP）引导的靶向脂质体。

Introduction

能够特异性结合靶分子的脂质膜胶囊是药物递送、基因治疗和疫苗开发应用的宝贵工具[[1], [2], [3]]。构建此类靶向脂质容器，大多数情况下采用配体分子或抗体与脂质颗粒的化学偶联方法。然而，这种方法需要多步反应，即固定化蛋白的制备、颗粒形成和化学偶联。这些方法除了成本高的问题外，还存在被意外化学品或病毒污染的风险。更糟糕的是，这些方法不适合高通量筛选。因此，迫切需要开发一种新技术来生产呈现靶标特异性结合蛋白的脂质纳米胶囊。此类方法必须适用于高通量实验、快速且无意外污染。开发满足这些特性的平台技术有望加速靶向药物递送疗法和基因治疗。

传统化学修饰方法的一个主要瓶颈在于制备要固定在脂质体表面的蛋白质，当从大量蛋白质库中筛选最具活性的候选物时，这一问题变得尤为突出。关于这个问题，无细胞系统[4]，一种体外蛋白质合成系统，有望解决这个问题，因为它允许同时并行生产多种蛋白质。此外，如果蛋白质在合成过程中就能整合到脂质体膜上，就可以完全绕过固定化步骤，从而显著减少传统工艺相关的时间和制造成本。此外，由此产生的装饰有蛋白质的脂质体能够通过超速离心或超滤装置轻松地从无细胞组分混合物中分离出来。

PURE系统是一种仅包含纯化转录和翻译因子的重构无细胞系统，能够在纯化条件下合成蛋白质，消除意外的副反应[5]。与大多数基于某种细胞提取物（如大肠杆菌或酵母胚芽）的其他无细胞系统不同，PURE系统可以大大降低来自活细胞的污染风险，因为它是一个重构系统。过去已有几次尝试使用PURE系统合成抗体[[6], [7], [8]]。考虑到PURE反应混合物的资源有限，合成低分子量抗体（如纳米抗体或亲和体）以最大化产物浓度更为有利[9,10]。此外，膜蛋白通常在活细胞系统中难以表达和纯化，却可以在无细胞系统中无障碍合成，因为它们不受细胞存活能力的限制。

脂质体是直径约100纳米的纳米颗粒，主要由磷脂形成，由于内部是中空的，因此作为运输容器非常有用。脂质体和无细胞系统的技术组合已很好地用于在脂质体膜上生产功能性膜蛋白[[11], [12], [13]]。有趣的是，在许多此类情况下，无细胞合成的膜蛋白可以通过疏水相互作用自发整合到脂质双分子层中[14,15]。这种方法也已发展到在脂质体膜上呈现抗体和配体蛋白[[15], [16], [17], [18]]。然而，可溶性蛋白（如抗体）即使存在脂质体也无法自然结合膜，因此需要一些额外的技巧在蛋白质合成过程中将其定位到膜上。

在本研究中，我们探索并发现了几种在无细胞合成过程中将可溶性蛋白引导至脂质体膜的肽。这些肽的氨基酸序列来源于先前研究的膜蛋白跨膜区[11,13,[19], [20], [21]]。将这些肽置于目标蛋白的N端或C端，可有效引导其定位于脂质体膜。带有MLP序列的抗HER2纳米抗体被定位到脂质体膜上，并观察到它们与高表达HER2的乳腺癌细胞特异性结合。在本报告中，我们将介绍独特的膜定位肽以及使用它们无细胞合成抗体展示脂质体的方法。

Section snippets

Exploration and evaluation of membrane localization peptides

选择了五种膜蛋白作为膜定位肽（MLP）的候选物，预计可将亲水性蛋白引导至脂质膜（图1a）。所有这些蛋白先前已被证明可通过PURE系统合成并自发插入脂质膜[11,12,[19], [20], [21]]。F_oF₁-ATP合酶的b亚基蛋白（ATPb）和细胞分裂蛋白ZipA（ZipA）在其蛋白质序列的N端具有单个跨膜（TM）结构域。

Discussion

利用人工细胞技术，我们在以往研究中通过无细胞系统合成的膜蛋白TM区中发现了MLPs。我们发现的MLPs显示出以超过70%的高效率将可溶性蛋白共翻译定位到脂质体膜上的功能。分子模拟分析表明PlsY_MLP和ATPb_MLP并未穿透膜，但足以将伴随蛋白定位在膜上。当MLP置于纳米抗体的N端或C端时，该功能得以实现，并且所展示的纳米抗体保持了其特异性结合活性，正如它们与表达靶抗原（HER2）的细胞结合所证明的那样。我们预计这种新方法将大大减少制备靶向脂质体所需的时间和劳动力，并将为基于脂质体的DDS（药物递送系统）的高通量筛选开辟道路。此外，由于该方法基于PURE系统，污染风险极低，因此适用于医药应用。