脂质纳米颗粒中mRNA活性丧失的机制研究：聚焦脂质过氧化物介导的mRNA加合作用对产品质量控制的关键意义

《Communications Chemistry》：Spotlighting the criticality of lipid quality control through a mechanistic investigation of mRNA activity loss in lipid nanoparticles

本期推荐：为解决脂质纳米颗粒(LNP)中mRNA活性异常丧失的问题，研究人员开展了mRNA脂质加合作用机制研究。发现不饱和离子化脂质中的过氧化物降解产生活性醛类物质，与mRNA形成加合物，导致翻译效率下降。该研究强调了脂质质量控制在mRNA疫苗开发中的关键意义。

　　

在新冠疫情推动下，脂质纳米颗粒(LNP)作为mRNA疫苗的递送系统迅速走向全球应用前沿。然而，这一创新技术背后隐藏着一个棘手难题：即使在mRNA完整性保持完好的情况下，LNP制剂仍会出现意想不到的活性丧失现象。这就像一辆外观完好但引擎失灵的跑车，令科研人员困惑不已。更令人担忧的是，维持LNP稳定性需要超低温储存条件，这大大限制了其在资源有限地区的应用，并显著增加了治疗成本。

在《Communications Chemistry》最新发表的研究中，Richard S. Kang、Zhichun Wang等研究人员揭开了这一谜团的关键面纱。他们发现，问题的根源并非mRNA本身的不稳定性，而是脂质成分中的"隐形杀手"——离子化脂质中的过氧化物降解产物。这些活性物质像"分子胶水"一样，与mRNA形成共价加合物，悄无声息地破坏其翻译功能。

研究人员采用了一系列先进的分析技术来解开这一复杂机制。核心方法包括离子对反相液相色谱(IP-RP)用于检测mRNA脂质加合程度，液相色谱-质谱联用(LC-MS)用于精确鉴定脂质过氧化物物种及其mRNA加合物的化学结构，脂质分馏和加标实验用于验证过氧化物的直接作用，以及mRNA寡核苷体质谱分析用于表征加合物的精确分子量。此外，还通过体外活性实验评估加合对蛋白表达的影响，并通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析脂质中过渡金属含量。

Detection of mRNA lipid adduction in LNPs

研究人员首先观察到，在分析包裹自扩增mRNA(sa-mRNA)的LNP时，离子对反相色谱出现了一个独特的晚期洗脱峰，与完整的sa-mRNA主峰完全分离。这个晚期峰的面积百分比随储存温度升高而显著增加，在2-8°C储存条件下尤为明显，表明存在热敏感性的mRNA修饰。重要的是，这种晚期峰的出现与mRNA完整性无关，但与蛋白表达下降直接相关。

Screening of lipids in mRNA lipid adduction

通过系统筛选LNP中各脂质成分，研究团队确认离子化脂质(IL)是导致mRNA脂质加合的唯一责任组分。只有包含IL的混合物才会产生晚期洗脱峰，而其他脂质成分（胆固醇、磷脂、PEG脂质）单独或组合使用均不产生此现象。

Evaluation of ionizable lipid species related to lipid adduction

比较不同批次的IL发现，脂质加合程度存在显著差异。LC-MS分析揭示，早期洗脱的+32 Da物种（过氧化物）的丰度与脂质加合水平直接相关，而+14 Da和+16 Da氧化物种则无此相关性。

LC-MS analysis of the +32 Da species

通过MS2碎片分析，研究人员确认+32 Da物种为脂质尾部过氧化物。IL的脂质尾部类似于多不饱和脂肪酸(PUFA)，含有丰富的双键，特别容易发生氧化。特征性的-140 Da和-88 Da中性丢失产物证实了C9和C13位置的过氧化。

Evaluation of IL peroxide species spiking

为了直接验证过氧化物的作用，研究人员分离了IL中的+32 Da物种并加入IL和sa-mRNA混合物中，结果导致脂质加合显著增加。而使用完全饱和尾部的不含双键的IL变体(IL-F)时，即使加入过氧化物也能产生加合，证明不饱和尾部是反应性物种的来源。

MS analysis of lipid adduction in mRNA oligomers

使用45聚体mRNA(ODN45)进行精确质谱分析，发现了两个主要的加合物簇：早期洗脱物种（100-160 Da delta mass）和晚期洗脱物种（600-850 Da delta mass）。其中最丰富的加合物质量与4-氢过氧壬烯醛(4HNE)的"尾部"醛类产物（154.1 Da）以及氧化变体的"体部"+"尾部"组合质量（777.6 Da等）高度匹配。

MS analysis of lipid adduction in DLin-MC3-DMA/oligomer mixtures

在知名离子化脂质DLin-MC3-DMA(MC3)中也观察到类似现象，证实了脂质过氧化物降解产生活性醛类并加合mRNA的机制具有普适性。

这项研究首次在LNP稳定性、离子化脂质质量控制和疫苗产品开发背景下，系统阐明了离子化脂质通过过氧化物降解产物介导mRNA脂质加合的分子机制。研究人员提出了一种创新模型：mRNA磷酸基团通过静电作用与离子化脂质的叔胺接近，而过氧化的脂质尾部暴露于水环境后降解为醛类产物，这些活性醛类进而与邻近mRNA中的氨基反应形成加合物。

该研究的深刻意义在于揭示了脂质质量控制在mRNA-LNP制剂开发中的关键作用。不饱和双键作为氧化的"热点"，其过氧化产物不仅影响产品稳定性，更直接损害治疗效果。特别是对于更长的sa-mRNA构建体，单个mRNA分子的失活就会对整体功效产生更大影响。研究强调，必须建立严格的原辅料质量控制标准，开发特异性监测方法，并考虑脂质设计中的氧化抗性，才能确保mRNA药物的安全性和有效性。这一发现为提升LNP产品的热稳定性和延长保质期提供了重要理论依据，对推动基因药物在更广泛领域的应用具有里程碑意义。