基于酪胺记忆效应纳米点组装体的自催化合成及其在心肌肌钙蛋白I外泌体双通道免疫分析中的应用

本文报道了一种基于酪氨酸-铂纳米点（Pt NDs-Tyr）和酪氨酸碳点（C-dots-Tyr）自催化组装策略合成的具有酪胺结构记忆效应的纳米点组装体（nanodot assemblies）。该组装体兼具纳米酶（nanozyme）活性和荧光特性，成功构建了用于检测血液及外泌体中心肌肌钙蛋白I（cTnI）的双模式（比色-荧光）免疫分析平台（Na-ELISA）。研究表明，该平台对急性心肌梗死（AMI）具有高诊断价值，尤其外泌体cTnI检测特异性显著优于血液cTnI。

　　

亮点

我们通过酪氨酸-铂纳米点（Pt NDs-Tyr）和酪氨酸碳点（C-dots-Tyr）的自催化组装策略，合成了具有酪胺结构记忆效应的纳米点组装体。

我们发现所制备的纳米点组装体同时具备纳米酶（nanozyme）活性和荧光特性。

我们证明了基于纳米点组装体的酶联免疫吸附试验（Na-ELISA）易于适应血液和细胞来源外泌体中心肌肌钙蛋白I（cTnI）的比色-荧光检测，并且能够检测其他生物标志物，包括甲胎蛋白（alpha-fetoprotein）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen）。

此外，该平台能够鉴定临床样本中的人心肌细胞损伤和急性心肌梗死（AMI）。总而言之，当前工作突出了基于纳米点组装体的双模式免疫分析在AMI中的诊断应用。目前使用纳米点组装体进行cTnI检测以及外泌体cTnI检测，简化了系统设计，并提高了AMI诊断的特异性。

引言

心脏特异性肌钙蛋白I是诊断心肌损伤的首选生物标志物，因为它在心脏损伤后会释放到外周血中[1]。然而，cTnI对心脏损伤并不特异，因为其在化疗[2]、肾功能衰竭[3]和肺栓塞[4]期间也会升高。cTnI的非特异性来源降低了其作为诊断标志物的准确性。外泌体是由细胞产生的膜囊泡，携带母细胞蛋白质和核酸[5,6]。特别是，外泌体蛋白在提高液体活检准确性方面显示出巨大潜力[7,8]。不幸的是，由于复杂的生物流体干扰和外泌体中蛋白质的低丰度，外泌体蛋白的准确定量检测在技术上仍然具有挑战性。因此，开发一种灵敏且简化的生物检测方法来检测外泌体中的cTnI对于促进AMI的准确诊断是非常必要的。

最近，基于纳米材料的酶联免疫吸附测定（ELISA）已成为检测cTnI的关键方法[[9], [10], [11], [12], [13]]。然而，传统的免疫分析方法难以检测低丰度的cTnI[14]。酪胺探针的引入使得开发高灵敏度的免疫分析方法作为传统方法的替代方案成为可能。侯等人利用HRP-酪胺偶联物构建了用于ECA的超灵敏免疫分析[15]。周等人设计了一种通过HRP-酪胺偶联物探针灵敏检测CEA的电化学免疫分析方案[16]。刘等人通过酪胺-生物素偶联物设计了用于SARS-CoV-2检测的超灵敏ELISA[17]。这些酪胺偶联物信号放大有效提高了ELISA的灵敏度，并成功实现了低丰度蛋白质标志物的检测。然而，已报道的基于酪胺探针的化学或生物传感器仅通过催化活性或荧光特性的单一模式实现。因此，同时利用酪胺探针的催化活性和荧光特性以实现更高的准确度和精密度是非常可取的。

纳米点组装体，一种独特的超级纳米粒子，在生物传感方面显示出巨大潜力。具体来说，通过共组装同质或异质纳米点可以构建具有高荧光强度和多色能力的组装体。目前这些组装体的制备途径包括乳液引导组装、表面耦合或基质负载方法[[18], [19], [20]]。然而，这些方法受限于复杂的制备方案和繁琐的表面修饰。因此，制备具有“结构记忆”功能的纳米点是实现高效组装的关键。值得注意的是，酪氨酸衍生的碳点（C-dots-Tyr）保留了表面结合的酪氨酸前体[21,22]。此外，我们之前的研究表明，由酪氨酸还原的铂纳米点（Pt NDs-Tyr）表面含有酪氨酸残基[23]。基于这些发现，我们假设利用Pt NDs-Tyr固有的自催化能力可以驱动其与C-dots-Tyr的共组装。这种有机组合使得催化活性与荧光特性得以有效结合，从而建立一种具有酪胺放大效应（TSA）的新型双模式检测探针。

针对上述挑战，我们通过Pt NDs-Tyr的自催化作用并与C-dots-Tyr共组装，开发了一种具有酪胺结构记忆效应的纳米点组装体探针，用于外泌体cTnI的双模式检测（方案1）。与现有的酪胺偶联物生物传感分析相比，该纳米点组装体平台具有三个显著优势。首先，我们提出了一种自催化组装策略来设计和制备双模式纳米点组装体探针，无需偶联剂。其次，纳米点组装体结合了C-dots-Tyr的荧光特性和Pt NDs-Tyr的催化活性，能够实现自校正定量检测。第三，纳米点组装体仍然保留TSA效应，并且易于适用于免疫分析系统。本研究表明，纳米点组装体平台对cTnI表现出增强的分析性能，能够检测低至3 pg/mL的浓度，检测范围为0.024 ng/mL至0.19 ng/mL，这比ELISA系统（390 pg/mL）灵敏度提高了约130倍。我们评估了AMI患者（n = 40）和健康对照（n = 30）的外泌体cTnI和血液cTnI水平。结果表明，外泌体cTnI能够以96%的准确度区分AMI，而血液cTnI的准确度为82%。我们提出，通过酪胺放大效应增强的纳米点组装体探针是进行外泌体cTnI分析的一个有价值的工具。

纳米点组装体的设计合成与表征

纳米点组装体通过自催化组装策略合成。在此过程中，Pt NDs-Tyr发生自催化产生酪胺自由基，随后与C-dots-Tyr共组装形成纳米点组装体（图1A）。首先，使用TEM和DLS对预制备的Pt NDs-Tyr进行了表征。如图1B所示，Pt NDs-Tyr表现出优异的分散性，没有明显聚集。高分辨率TEM（HRTEM）图像显示0.225 nm处的清晰晶格条纹，对应于Pt（111）晶面（图1C）。动态光散射（DLS）分析表明Pt NDs-Tyr的平均流体动力学直径约为2.8 nm（图1D）。随后，通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱对C-dots-Tyr进行了表征。C-dots-Tyr在275 nm处显示出典型的吸收峰，归因于酪氨酸残基的芳香环（图1E）。在320 nm激发下，C-dots-Tyr在445 nm处表现出强烈的蓝色荧光发射（图1F）。这些结果表明成功合成了Pt NDs-Tyr和C-dots-Tyr。

接下来，我们研究了Pt NDs-Tyr在过氧化氢（H₂O₂）存在下的自催化行为。如图2A所示，Pt NDs-Tyr可以催化H₂O₂分解产生羟基自由基（•OH），进而氧化酪氨酸残基产生酪胺自由基。电子自旋共振（ESR）光谱证实了•OH的产生（图2B）。为了验证酪胺自由基在共组装中的作用，我们比较了有/无H₂O₂处理时Pt NDs-Tyr和C-dots-Tyr的混合溶液。只有在H₂O₂存在下，我们才观察到纳米点组装体的形成，这表明酪胺自由基驱动了组装过程（图2C）。透射电子显微镜（TEM）图像显示，形成的纳米点组装体是平均直径约为85 nm的球形纳米结构（图2D）。纳米点组装体在265 nm和445 nm处显示出紫外吸收峰，分别对应于Pt NDs-Tyr和C-dots-Tyr的特征吸收（图2E）。重要的是，纳米点组装体保留了C-dots-Tyr的荧光特性，在445 nm处有强发射（图2F），同时表现出类似于Pt NDs-Tyr的过氧化物酶样活性，可以催化TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）产生蓝色氧化产物（图2G）。这些表征证实了我们成功制备了兼具催化活性和荧光特性的纳米点组装体。

基于纳米点组装体的双模式免疫分析性能

基于纳米点组装体的双重信号输出（催化活性和荧光），我们建立了一种用于cTnI检测的双模式免疫分析（Na-ELISA）。该检测原理如图3A所示：首先，捕获抗体被固定在微孔板表面；然后，加入含有cTnI的样本，cTnI被捕获抗体结合；接着，加入检测抗体（HRP标记）和纳米点组装体探针。HRP催化H₂O₂产生•OH，进而激活纳米点组装体探针的酪胺信号放大（TSA）效应，导致大量纳米点组装体沉积在检测位点。最后，通过测量TMB氧化产物的吸光度（比色信号）或纳米点组装体自身的荧光强度（荧光信号）来定量cTnI。

我们首先优化了检测条件，包括抗体浓度、孵育时间和H₂O₂浓度。在最优条件下，我们评估了Na-ELISA对cTnI的分析性能。如图3B所示，比色信号和荧光信号均与cTnI浓度在0.024 ng/mL至0.19 ng/mL范围内呈良好的线性关系。比色模式和荧光模式的检测限（LOD）分别计算为3.5 pg/mL和2.8 pg/mL，远低于传统ELISA的检测限（390 pg/mL）。这表明Na-ELISA的灵敏度比传统ELISA提高了约130倍。该方法还表现出良好的重复性（批内和批间变异系数均<10%）和准确性（回收率在95%-105%之间）。

为了评估该平台的特异性，我们测试了cTnI与其他类似物，如心肌肌钙蛋白C（cTnC）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）和牛血清白蛋白（BSA）的交叉反应。结果如图3C所示，只有cTnI产生了强烈的信号，而其他蛋白质的信号与背景相当，表明Na-ELISA对cTnI具有高特异性。此外，我们将该方法应用于检测其他生物标志物，包括甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA），也取得了令人满意的结果（图3D），证明了该平台的普适性。

临床样本分析

为了验证Na-ELISA的临床实用性，我们使用该平台检测了40例AMI患者和30例健康对照者的血液样本和外泌体样本中的cTnI水平。首先，我们通过超速离心从血浆中分离出外泌体，并使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）和Western blotting对外泌体进行了表征（图4A，4B）。结果表明成功分离出具有典型外泌体特征（尺寸约100 nm，表达CD63和TSG101标志蛋白）的囊泡。

随后，我们分别测量了血液cTnI和外泌体cTnI的浓度。如图4C所示，AMI患者组的血液cTnI和外泌体cTnI水平均显著高于健康对照组。值得注意的是，外泌体cTnI在两组间的差异比血液cTnI更为明显。受试者工作特征（ROC）曲线分析用于评估血液cTnI和外泌体cTnI在诊断AMI方面的性能。如图4D和表1所示，外泌体cTnI区分AMI的曲线下面积（AUC）为0.98，准确度达到96%，灵敏度和特异性分别为95%和97%。相比之下，血液cTnI的AUC为0.89，准确度为82%，灵敏度和特异性分别为85%和80%。这些结果清楚地表明，与外泌体cTnI相比，血液cTnI在区分AMI患者和健康个体方面具有显著优势。这表明外泌体cTnI是一个更特异、更准确的AMI诊断标志物。

此外，我们还利用该平台评估了阿霉素（Doxorubicin）诱导的人心肌细胞（AC16细胞）损伤模型中的cTnI释放。结果显示，随着阿霉素浓度增加，细胞上清液和外泌体中的cTnI水平均升高，且外泌体cTnI的变化更为显著（图4E）。这进一步证实了外泌体cTnI在检测心肌细胞损伤方面的敏感性。

结论

总之，我们提出了精心设计的具有酪胺结构记忆效应的纳米点组装体，以开发用于外泌体cTnI的双模式免疫分析，从而实现心肌细胞损伤的检测和AMI的诊断。纳米点组装体由Pt NDs-Tyr和C-dots-Tyr组成，可以通过自催化组装策略高效合成。通过整合催化和荧光特性，建立了一个适用于临床应用的双模式免疫分析。由于酪胺信号放大效应，该免疫分析对cTnI的检测灵敏度达到3 pg/mL，比传统ELISA提高了约130倍。重要的是，临床样本验证表明，外泌体cTnI在诊断AMI方面（准确度96%）比血液cTnI（准确度82%）具有更高的准确性和特异性。因此，这种基于纳米点组装体的双模式免疫分析平台为生物标志物检测提供了一种强大而可靠的工具，在疾病诊断领域具有广阔的应用前景。